薛佳韻， 趙明霞， 王澤建， 孫慧婕， 王永紅， 儲 炬， 莊英萍

（1.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2.蘇州大學醫(yī)學部藥學院，江蘇蘇州 215123）

尼莫克汀(Nemadectin)是一種米爾貝霉素類(Milbemycin)十六元大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，它是由藍灰色鏈霉菌Streptomyces cyaneogriseus ssp.noncyanogenus所生產(chǎn)的一種廣譜殺蟲劑[1-2]。通過在尼莫克汀的第23 位引入=N?OCH3基團可半化學合成莫西克汀(Moxidectin)，其具有高效、安全、環(huán)保以及不易產(chǎn)生抗藥性等特點[3-7]，因此在農(nóng)用驅蟲類殺蟲劑領域具有廣闊的應用前景[4,8-11]。此外，莫西克汀在治療盤尾絲蟲病方面也十分有效[6-7,12-13]。然而目前有關尼莫克汀的研究多集中于育種、分子機制以及毒理藥理等方面[14-19]，鮮有關于發(fā)酵調(diào)控方面的研究。

為了盡可能發(fā)揮出尼莫克汀生產(chǎn)菌株的性能，需要對尼莫克汀的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。在部分鏈霉菌生產(chǎn)抗生素過程中，添加豆油能夠有效提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量。趙素敏[20]通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5 g/L豆油，從而使雷帕霉素的產(chǎn)量提高至243 mg/L；卞晨光等[21]通過添加豆油使紅霉素的效價有效提高至5 221 U/mL，并推測豆油通過三羧酸循環(huán)代謝形成紅霉素合成前體2-甲基丙二酰輔酶A 從而促進紅霉素的合成；Wang 等[22]通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加豆油，有效促進FK506(Tacrolimus)的合成，并且通過蛋白組學和代謝組學分析發(fā)現(xiàn)豆油不僅作為碳源被利用，亦可促進FK506 前體代謝。綜合上述發(fā)現(xiàn)豆油的添加對部分大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的生產(chǎn)是有利的，然而目前鮮有關于豆油對尼莫克汀發(fā)酵的影響的研究。

本文通過考察豆油添加的不同質量濃度及時間，研究豆油對尼莫克汀發(fā)酵過程中菌體生長量以及產(chǎn)物濃度的影響，同時通過進一步考察5 L 反應器上尼莫克汀發(fā)酵過程的相關參數(shù)變化，合理分析了豆油在尼莫克汀合成過程中的作用。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

1.1.1 菌株及豆油來源 藍灰色鏈霉菌S-1(Streptomyces cyaneogriseus ssp.noncyanogenus) ，華東理工大學國家生化工程技術研究中心保存。

豆油選用金龍魚精煉一級大豆油（益海嘉里食品營銷有限公司），食用級豆油。

1.1.2 實驗儀器 5 L 反應器（中國上海國強生化工程裝備有限公司）：微生物發(fā)酵；MAX300-LG 型尾氣質譜儀（美國Extrel 公司）：尾氣中O2、CO2檢測；1100 series 型高效液相色譜（HPLC，美國Agilent Technologies Inc.Agilent）：尼莫克汀檢測；LC-20A 高效液相色譜（日本島津制作所）：有機酸檢測；顯微鏡（舜宇恒平科學儀器有限公司（上海）：菌形分析。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）斜面/平皿培養(yǎng)基(g/L)：麥芽糖1.3，酵母提取物4.0，硫酸鎂0.5，碳酸鈣1，瓊脂粉20，pH 7.0。

（2）種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，麥芽糊精20，黃豆餅粉15，棉籽餅粉15，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 1，pH 7.0。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，麥芽糊精85，黃豆餅粉25，玉米漿8，硫酸鎂1.0，硫酸銅0.01，氯化鈷0.002，硫酸鋅0.001，硫酸錳0.001，鉬酸鈉0.002，碳酸鈣6，消泡劑0.8（反應器上培養(yǎng)），pH 7.4。

1.1.4 培養(yǎng)方法

（1）孢子懸浮液制備

將藍灰色鏈霉菌S-1 接種于斜面培養(yǎng)基中，在28 °C 下培養(yǎng)7 d，待孢子成熟時用無菌0.9 g/L 氯化鈉溶液將孢子從斜面上刮洗下來并轉接至無菌的帶玻璃珠的250 mL 圓底三角瓶中，在220 r/min 轉速下振蕩3 min 以打碎菌絲釋放出孢子，轉接至無菌保菌管中備用。

（2）種子培養(yǎng)

使用500 mL 圓底三角瓶培養(yǎng)種子液。500 mL搖瓶裝液量50 mL，并使用8 層紗布封口。將1 mL約3×107CFU/mL 的孢子懸液加入種子培養(yǎng)基中，在28 °C，240 r/min 轉速下培養(yǎng)36 h，當離心壓縮體積(PMV)達到原來體積的20%時，轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基中。

使用500 mL 圓底三角瓶或5 L 反應器進行發(fā)酵培養(yǎng)。500 mL 搖瓶裝液量30 mL，并使用8 層紗布封口，5 L 反應器裝液量為3 L。按8%的接種量將種子液轉接到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中或反應器發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 °C 下培養(yǎng)240 h。

1.1.5 豆油補加方案 在500 mL 搖瓶發(fā)酵過程中，初始0 h 以及菌體分化36 h 時一次性添加不同的最終質量濃度(0.25～15 g/L)的豆油，添加體積根據(jù)相應質量濃度計算。5 L 培養(yǎng)過程中實驗是在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中直接加入4.5 g 豆油。

1.2 參數(shù)測定

（1）菌體濃度測定

通過PMV 法測定發(fā)酵液中菌體濃度。取樣10 mL發(fā)酵液于10 mL 離心管中，在4 000 r/min 轉速下離心10 min后，將上清液與沉淀分離，沉淀物體積在10 mL 體積中所占百分數(shù)即為菌體PMV。

將沉淀用生理鹽水清洗過后，重懸并抽濾，然后在烘干的濾紙(質量已知)上，85 °C 下烘至恒重后測定濾紙和沉淀質量，沉淀物的質量除以取樣體積即為干重(DCW)。

（2）尼莫克汀產(chǎn)量測定

尼莫克汀產(chǎn)量通過HPLC 進行檢測。采用安捷倫C18柱進行分離，流動相為1 mL/min 的甲醇和水混合液（甲醇和水體積比為9∶1）進行洗脫，柱溫為30 °C，檢測波長為245 nm。

（3）pH 測定

學生成績的好壞，跟他的聽課效率是密不可分的。而聽課也要講究方法。教師要引導學生明確聽課的重要性，聽課要專心致志，邊聽邊思考，前后聯(lián)系，不懂就問。同時還要將自己所聽到的信息加以分析、歸納、整理、記錄，這樣才能更好地記憶與復習。

采用METTLER TOLEDO F120 型測試儀進行pH 測定。

（4）總糖濃度測定

總糖濃度采用3,5?二硝基水楊酸（DNS）法測定[23]。

（5）細胞活性測定

采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定細胞活性：在發(fā)酵液中添加200 μL 發(fā)酵液、1 mL、0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH=7.0)和50 μL、0.5 g/L TTC 溶 液 混 勻 后 在40 °C 下 培 養(yǎng)3 h，然 后 通 過12 000 r/min 的轉速離心去除上清液，在沉淀中加入1 mL 甲醇并超聲30 min 以提取胞內(nèi)TPF，最后使用96 孔板以及酶標儀在485 nm 下進行吸光度測定。

（6）胞外有機酸測定

胞外有機酸通過HPLC 進行分析。HPLC 配備離子排斥柱和吸收檢測器分光光度計。采用安捷倫H 柱進行分離，流動相為0.5 mL/min 的10 mmol/L H2SO4，柱溫為50°C，檢測波長為210 nm。

（7）在線氧攝取率（OUR）檢測

2 結果與討論

2.1 搖瓶發(fā)酵中豆油添加對尼莫克汀產(chǎn)量的影響

2.1.1 搖瓶發(fā)酵中豆油不同添加模式對尼莫克汀效價的影響 通過在不同時間（0 h 和36 h）添加不同質量濃度（0.25，0.5，0.75，1，1.5，2.3，5，7，10，15 g/L）豆油，考察豆油添加對尼莫克汀的發(fā)酵影響，結果如圖1所示。500 mL 搖瓶發(fā)酵周期為192 h。如圖1 （a）所示，隨著添加豆油質量濃度的提高，尼莫克汀產(chǎn)物質量濃度均呈先增長后降低的趨勢，在所有實驗組中，0 h 添加1.5 g/L 豆油以及36 h 添加1 g/L 豆油時尼莫克汀產(chǎn)物質量濃度最高，分別達到1 370 μg/mL 和1 355 μg/mL，比對照組(1 210 μg/mL)分別增長了13.22%和11.98%。當添加的豆油質量濃度超過5 g/L時，尼莫克汀的質量濃度則會急劇下降。

另一方面，豆油添加對菌濃維持有利。如圖1(b)所示，所有的豆油添加均能有效提高菌濃。其中在初始培養(yǎng)基中添加1.5 g/L 豆油，發(fā)酵終菌濃比對照組增長了20.7%。但隨著豆油質量濃度的進一步提高，菌濃會逐步下降。

2.1.2 搖瓶發(fā)酵中豆油不同添加模式對發(fā)酵比產(chǎn)率的影響 從基于菌體的產(chǎn)物得率Yp/c結果(圖1（e）、（f）)可知，豆油初始添加組的Yp/c普遍低于對照組，且在低質量濃度豆油范圍下Yp/c與對照組相近，而隨著豆油質量濃度的增加，Yp/c在不斷降低。而在36 h 添加組中，Yp/c的變化趨勢與總效價的變化趨勢相似。其中，添加1 g/L 豆油條件下Yp/c達到63.59 mg/g，遠高于對照組。

圖1 不同豆油添加質量濃度下對藍灰色鏈霉菌生長代謝影響Fig.1 Effects of soybean oil on S.cyaneogriseus growth and metabolism under different feeding modes

豆油作為一種碳源，在供氧充足的條件下很容易被好氧菌代謝利用，而在這個過程中，能夠產(chǎn)生抗生素合成所需的?；o酶A 和大量能量。綜上可以推斷，0 h 添加的豆油主要被菌體用作碳源或提供初級代謝能量，有效提高菌體生長量，但隨著豆油質量濃度進一步增加，過于豐富的碳源使得菌體短時間內(nèi)生長旺盛，導致發(fā)酵液黏度大幅度上升，造成搖瓶上氧傳遞限制，反而對菌體次級代謝產(chǎn)生負面影響；而在36 h添加豆油時，低質量濃度的豆油添加直接被利用作前體或是次級代謝能量供給，提高了菌體產(chǎn)物合成能力，增強了菌體的前體代謝，同時也能有效維持菌濃。而高質量濃度的豆油可能導致氣泡的快速聚并，從而引起氧傳遞限制，反而不利于菌體的代謝。

2.2 搖瓶豆油添加對發(fā)酵周期影響

此外，豆油添加對尼莫克汀發(fā)酵周期也有一定影響。分別在發(fā)酵了192 、216 、240 h 的搖瓶中進行取樣，考察豆油添加對尼莫克汀的發(fā)酵過程菌體生長和產(chǎn)物合成的影響，結果如圖2 所示。搖瓶發(fā)酵總周期為240 h。由圖2 可知，豆油添加對整個尼莫克汀發(fā)酵周期有一定的延長作用。0 h 時添加低質量濃度豆油(0.25～1.5 g/L)可以合成大量前體物質和能量，使得產(chǎn)物合成期被延長，從而有利于產(chǎn)物合成，而36 h 時添加低質量濃度豆油則主要作為前體被利用，能夠促進菌體次級代謝活性并延緩菌體死亡。當豆油添加質量濃度較高(7～15 g/L)時，由于搖瓶供氧能力有限，造成氧傳遞限制，不利于菌體呼吸代謝，致使合成期被延滯。隨著豆油不斷被消耗，濃度不斷降低，氧傳遞限制逐漸被解除，菌體則又開始生長及合成，但由于整個發(fā)酵周期被延長，導致發(fā)酵結束時的效價仍處于較低水平，發(fā)酵過程生產(chǎn)效率較低。

2.3 5 L 反應器中豆油添加對尼莫克汀發(fā)酵過程的影響

為了進一步詳細分析豆油對生產(chǎn)菌菌體生長和產(chǎn)物合成代謝的影響，本文在5 L 高級發(fā)酵罐系統(tǒng)中進行了過程動態(tài)多參數(shù)采集，結合離線(菌形、菌濃及尼莫克汀產(chǎn)量等)和在線參數(shù)(溶氧、氧攝取率及pH 等)分析豆油對生產(chǎn)菌代謝的影響及控制。搖瓶實驗結果顯示，初始添加1.5 g/L 豆油能有效提高生物量以及尼莫克汀的產(chǎn)量，因此，選擇在5 L反應器上考察初始添加1.5 g/L 豆油對尼莫克汀發(fā)酵過程的影響。

圖2 不同豆油添加質量濃度下尼莫克汀的效價變化Fig.2 Changes of nemadectin titer at different mass concentrations of soybean oil

2.3.1 豆油添加對菌形的影響 圖3 所示為不同培養(yǎng)條件下藍灰色鏈霉菌的菌形變化。從圖中可發(fā)現(xiàn)，生長期的菌絲逐漸伸長，菌絲體聚集成團粒，48 h時菌絲團開始分化，菌絲開始變短，斷裂的小菌絲也有所增多。比較豆油組和對照組，結果表明72 h 以后，豆油組還有部分小菌絲團，而對照組已基本完全碎裂成小菌絲，這說明豆油的添加對菌絲團的維持有一定的作用。相關研究表明，部分鏈霉菌的產(chǎn)物合成與菌形變化存在一定關系，部分鏈霉菌在絲狀菌絲狀態(tài)下的產(chǎn)物合成能夠有所增加[24]，但如果菌絲斷裂嚴重，對產(chǎn)物合成速率也會有顯著的負面影響[25]。尼莫克汀發(fā)酵過程中后期，產(chǎn)物質量濃度較高的條件下菌絲會更長，同時也能維持一定的菌絲團形態(tài)[17]，而豆油的添加能夠較好地維持這種菌絲團，這有可能有效維持次級代謝產(chǎn)物的合成。

2.3.2 豆油添加對菌體生物量及細胞活性的影響 圖4 示出了初始添加豆油（1.5 g/L）條件下5 L 反應器中藍灰色鏈霉菌生長相關參數(shù)的變化情況。在菌體生物量方面，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，0～36 h 菌體處于生長期，菌濃不斷提高，經(jīng)過短暫穩(wěn)定期后生物量從48 h開始逐漸下降并進入次級代謝，而此時尼莫克汀大量合成。比較豆油組和對照組的發(fā)酵過程曲線變化發(fā)現(xiàn)，在初級代謝階段，添加豆油后菌體的生長量較對照組有明顯增加(圖4 （a）、（b）、（c）)，豆油添加組最大菌濃(PMV 達到了38.76%)比對照組的最大菌濃(PMV 為30.05%)高出了29%，并且最高比生長速率分別達到0.024 9 h?1和0.023 7 h?1。當菌體進入尼莫克汀合成期后，豆油組的PMV 一直處于較高的水平，至發(fā)酵中后期PMV 仍能維持在22%以上，表明豆油的添加能夠有效維持次級代謝階段的菌濃。

另一方面，豆油組的細胞活性水平始終高于對照組(圖4（d）)，而葡萄糖消耗情況(圖5)表明在生長期(0～48 h)間，豆油添加組的葡萄糖消耗速率要略高于對照組。這些都表明豆油添加能夠有效提高藍灰色鏈霉菌的初級代謝活性并提供能量，從而有利于菌體的生長和維持。

2.3.3 豆油添加對產(chǎn)物合成的影響 在產(chǎn)物合成方面(如圖6 和表1)，與對照組相比，豆油添加組尼莫克汀效價為1 475 μg/mL，相對于對照組(1 158 μg/mL)提高了27.37%。與此同時，豆油組的最高合成速率約為10.839 μg·/（mL·h），比對照組高了約24.61%，過程中合成速率也明顯高于對照組。此外，豆油組的比產(chǎn)率至發(fā)酵結束依然能維持在約0.247 mg/（g·h），表明豆油的添加能有效維持次級代謝階段的菌體活性，有利于產(chǎn)物合成。

2.3.4 豆油添加對細胞呼吸代謝相關參數(shù)的影響 除了上述尼莫克汀發(fā)酵過程中生理代謝相關的離線參數(shù)外，結合動態(tài)采集及分析的在線參數(shù)能夠更全面地了解豆油對尼莫克汀發(fā)酵過程的影響。在實時采集的溶氧(DO)變化曲線中(圖7（a）)，兩種培養(yǎng)工藝之間的變化趨勢基本一致，但整個過程中，豆油組溶氧始終略低于對照組。實驗過程中進氣量、罐壓、轉速等均保持一致，由此可知豆油組對氧的需求要大于對照組組，且豆油組的生長狀態(tài)優(yōu)于對照組。

圖3 不同培養(yǎng)條件下藍灰色鏈霉菌菌體形態(tài)變化Fig.3 Morphological changes of S.cyaneogriseus under different conditions

另一方面，發(fā)酵過程中在線計算的OUR 變化曲線能夠直接反映細胞的代謝活性情況，結果如圖7（b）所示。如圖所示，豆油添加后菌體的OUR 最高能夠達到29.8 mmol/(L·h)，也明顯高于對照組的26.7 mmol/(L·h)，表明豆油添加能夠顯著促進菌體的初級代謝活力，促使菌體濃度的增加。在192～240 h間，豆油添加組的OUR 能維持在9 mmol/（L·h）左右，而對照組則呈快速下降趨勢，最低降至5 mmol/（L·h）左右，表明次級代謝階段豆油組菌體活力優(yōu)于對照組，能夠較好地維持產(chǎn)物合成活性。結合比生長速率變化(圖4 (c))、細胞活性結果(圖4 (d))及殘?zhí)亲兓?圖5 (a))，印證了豆油組條件下細胞代謝活性始終優(yōu)于對照組，有利于維持產(chǎn)物的合成。

2.3.5 豆油添加對pH 及胞外有機酸的影響 5 L 反應器系統(tǒng)動態(tài)采集的pH 變化情況如圖7（c）所示，對照組的pH 最低降至5.6，而豆油添加組的pH 最低則僅降至6.3；從24 h 起兩組pH 均開始逐步回升，豆油組在66 h 左右pH 穩(wěn)定在7.7 附近，而對照組則在約96 h 時才穩(wěn)定在7.7 附近。

為了考察發(fā)酵過程中pH 產(chǎn)生變化的原因，對胞外有機酸進行了測定(圖8 )。發(fā)酵過程中主要檢測到的胞外有機酸為α-酮戊二酸(AKG)和丙酮酸(PYR)。通過考察這兩者的變化情況，發(fā)現(xiàn)在生長期(0～48 h)胞外有機酸積累量較大，間接表明菌體的初級代謝活性較高，并且積累了大量能量，這也佐證了之前的推測。在48 h 后，兩組的胞外丙酮酸質量濃度趨于0，而α-酮戊二酸的質量濃度也開始下降，表明菌體開始進入次級代謝狀態(tài)。

圖4 初始添加豆油(1.5 g/L)條件下的5 L 反應器中藍灰色鏈霉菌生長相關參數(shù)變化Fig.4 Effects of the initial addition of soybean oil (1.5 g/L) on the growth of S.cyaneogriseus during the 5 L fermentation process

圖5 初始添加豆油(1.5 g/L)條件下5 L 反應器中總糖的變化Fig.5 Effects of the initial addition of soybean oil (1.5 g/L) on the sugar consumption during the 5 L fermentation process

圖6 初始添加豆油(1.5 g/L)條件下5 L 反應器中尼莫克汀產(chǎn)物質量濃度的變化Fig.6 Effects of the initial addition of soybean oil (1.5 g/L) on the mass concentration of nemadectin production during the 5 L fermentation process

表1 不同發(fā)酵條件下尼莫克汀發(fā)酵參數(shù)匯總表Table 1 Calculated parameters of the different fermentation conditions by S.cyaneogriseus

圖7 初始添加豆油(1.5 g/L)條件下5 L 反應器中尼莫克汀合成相關的代謝參數(shù)變化Fig.7 Effects of the initial addition of soybean oil (1.5 g/L) on physiological parameters of nemadectin during 5 L fermentation process

圖8 初始添加豆油(1.5 g/L)條件下5 L 發(fā)酵過程中的胞外有機酸變化Fig.8 Effects of the initial addition of soybean oil (1.5 g/L) on extracellular organic acids during 5 L fermentation process

比較對照組和豆油組的胞外有機酸，發(fā)現(xiàn)0～48 h期間，對照組的胞外丙酮酸積累量高于豆油組，而α-酮戊二酸的含量則是豆油組高于對照組。丙酮酸是尼莫克汀合成前體輔酶A 物質的重要來源，而在供氧充足的條件下，豆油很容易通過Embden-Meyerhof-Parnas Pathway (EMP)以及Tricarboxylic Acid Cycle(TCA)途徑產(chǎn)生丙酮酸，促進抗生素合成所需的?；o酶A 和大量能量的積累，保證有充足的能量能夠順利進入呼吸鏈從而進行氧化磷酸化，更有利于菌體的代謝以及增強尼莫克汀的合成途徑。而由于對照組胞外丙酮酸的質量濃度較高，導致其pH 偏低，使得pH 回升會更慢。

3 結 論

本文通過在藍灰色鏈霉菌的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加豆油，得出如下結論：

(1) 添加低質量濃度豆油(0.25～5 g/L)可以有效提高菌體的生物量和產(chǎn)物合成單位，其作為碳源及能量供給，提高菌體的初級代謝活性，積累較多的生物量和能量，用于次級代謝過程中產(chǎn)物的合成，同時它也在一定程度上維持菌體的次級代謝活性，延長了尼莫克汀的有效發(fā)酵周期。

(2) 添加高質量濃度豆油時(7～15 g/L)，主要可能是由于高質量濃度的豆油帶來的氧限制問題不利于菌體的生長和代謝，只有當培養(yǎng)基中的豆油被不斷消耗至氧限制解除才能進行產(chǎn)物合成，導致菌濃維持較高但產(chǎn)物合成較低。

(3) 通過離線和5 L 反應器上的在線參數(shù)采集，并結合相關離線參數(shù)進行分析，結果表明，在藍灰色鏈霉菌菌濃方面，初始添加1.5 g/L 的豆油比對照組提高29%，尼莫克汀的產(chǎn)物濃度提高27.37%，達到1 475 μg/mL，說明豆油的添加能顯著提高尼莫克汀的生物合成。此外，在線分析的細胞呼吸代謝相關參數(shù)表明，豆油添加能夠有效提高藍灰色鏈霉菌的初級代謝活性，其三羧酸循環(huán)效率更高，提供產(chǎn)生的大量的Adenosine Triphosphate (ATP)和Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NADH)用于菌體的生長和維持，同時在一定程度上也能維持菌體的次級代謝活性，延長尼莫克汀的合成期。

綜上所述，在尼莫克汀的發(fā)酵過程中，通過添加一定量的豆油能夠較為有效地提高菌體合成，有利于生物量的積累和產(chǎn)物的生產(chǎn)。后續(xù)可以通過結合蛋白組學或代謝物組學深入研究豆油在藍灰色鏈霉菌中的代謝機理，從而更全面、更深入地了解豆油對尼莫克汀的發(fā)酵影響。