尉 文， 張夢(mèng)雪， 王學(xué)東

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

核黃素（Riboflavin）又名維生素B2（VB2），它是生物體內(nèi)重要的輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黃素單核苷酸（FMN）的前體物質(zhì)，這兩種輔酶在氧化還原反應(yīng)中作為電子受體，在生物代謝中起到重要作用[1]。核黃素常常用于醫(yī)藥和飼料添加劑、化妝品、食品等行業(yè)，其通常的合成方法為化學(xué)合成法和生物合成法[2-3]。隨著生物工程的發(fā)展，微生物發(fā)酵法以生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、原料廉價(jià)、環(huán)境友好以及資源可再生等優(yōu)點(diǎn)逐步取代傳統(tǒng)的化學(xué)合成法。

核黃素發(fā)酵的主要生產(chǎn)菌包括:棉阿舒氏囊霉（Ashbya gossypii）、阿舒氏假囊酵母（Eremothecium ashbyii）、無名假絲酵母（Candida famata）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等。目前，棉阿舒氏囊霉、無名假絲酵母和枯草芽孢桿菌等微生物已成功進(jìn)行基因工程技術(shù)改造，并成功應(yīng)用于核黃素的生產(chǎn)中[2]。相較于其他兩種菌株，枯草芽孢桿菌具有很多優(yōu)點(diǎn)，如原料要求低、發(fā)酵周期短、產(chǎn)量高等。因此目前核黃素主要通過基因改造過的枯草芽孢桿菌進(jìn)行生產(chǎn)，且對(duì)該菌株的發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)節(jié)代謝通量也可以極大提高核黃素的產(chǎn)量[3-6]。

在過去的10 年里，核黃素的研究主要集中在對(duì)生產(chǎn)菌株基因的分子修飾方面，鮮有對(duì)生產(chǎn)過程中的代謝調(diào)控尤其是氮代謝調(diào)控的研究，但氮源在菌體生長和核黃素生產(chǎn)中作用重要[7]。

本文針對(duì)不同的無機(jī)氮源及其組合對(duì)菌體生長和核黃素產(chǎn)量的影響進(jìn)行了詳細(xì)的研究，并對(duì)補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中銨離子濃度的調(diào)控策略進(jìn)行了改進(jìn)，以提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)核黃素能力。

1 材料與儀器

1.1 菌株

枯草芽孢桿菌，本文中使用的菌株由合作企業(yè)提供，該菌株已經(jīng)過8-氮鳥嘌呤（8-AGr），氯霉素（Cmr），麥角霉素（Emr）和卡那霉素（Kanr）選育。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，pH 7.0；

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 100，玉米漿（干粉）20，酵母粉 5，無水 MgSO45，（NH4）2SO45，KH2PO41，K2HPO43，pH 7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 100，玉米漿（干粉）30，酵母粉 5，尿素 5，無水MgSO41，（NH4）2SO45，KH2PO41.5，K2HPO42.42，pH 7.0。

1.3 主要儀器

GZX-9070MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；層析缸：上海楚定分析儀器廠；7 L 發(fā)酵罐：上海保興生物有限公司；SBA-40D 型葡萄糖檢測(cè)儀：山東省科學(xué)院生物研究所；UV2800 型紫外可見分光光度 計(jì)：UNIC 公司；Centrifuge 5415D/5804R：德國Eppendorf 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)條件：搖床溫度控制在40 ℃左右，轉(zhuǎn)速控制在180～200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間36 h；

搖瓶培養(yǎng)條件：接種量2%，培養(yǎng)溫度40 ℃，pH 7.0～7.2，轉(zhuǎn)速為180～200 r/min，培養(yǎng)周期48～60 h，結(jié)果重復(fù)3 次；

發(fā)酵培養(yǎng)條件：接種量2.5%，培養(yǎng)溫度40 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧20%以上，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，發(fā)酵36～48 h。

2.2 分析方法

2.2.1 菌體濃度（Cell density） 菌體濃度用吸光度值(OD) 表征，OD 值采用紫外-可見分光光度法測(cè)得：在600 nm 下測(cè)吸光度值（即OD600），一個(gè)單位的OD600對(duì)應(yīng)0.38 g 細(xì)胞干重。

2.2.2 核黃素測(cè)定 取發(fā)酵液用0.05 mol/L 的NaOH溶解20 min，在10 000 r/min 下離心3 min，上清液在444 nm 下測(cè)定吸光度值（A444），核黃素產(chǎn)率用A444除以0.064 2 來表示，單位為IU/mL。

2.2.3 銨離子濃度檢測(cè)方法 采用苯酚-次氯酸法檢測(cè)銨離子濃度，首先將2.5 mL A 溶液（濃縮苯酚62 g，硝基鐵氰化鈉25 g，定容為1 L，將其置于棕色瓶儲(chǔ)存在冰箱中）加入離心管中，然后加入20 μL 樣品，最后加入B 溶液（氫氧化鈉50 g、次氯酸鈉2.1 g，定容為1 L）。將混合溶液在37 ℃下水浴20 min，測(cè)量上清液在630 nm 處的吸光度值（A630），氨離子濃度（cNH+4，mmol/L）由計(jì)算公式A630= 0.084 8cNH+4+ 0.045 9(R2=0.999 5)得出[8]。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同氮源對(duì)菌體生長和核黃素產(chǎn)量的影響

根據(jù)玉米漿（西王集團(tuán)有限公司）和安琪酵母粉（安琪酵母股份有限公司）成分分析表，在初始培養(yǎng)基中，玉米漿中有機(jī)氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.58%，安琪酵母粉中有機(jī)氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.76%，尿素中有機(jī)氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.7%，所以在初始培養(yǎng)基中，有機(jī)氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.96%，無機(jī)氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.6%，對(duì)于有機(jī)氮源來說，成分復(fù)雜且影響因素較多，本文數(shù)據(jù)僅作參考。

為探究不同氮源對(duì)菌體生長和核黃素產(chǎn)量的影響，本實(shí)驗(yàn)將初始的發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，隨后添加幾種常見氮源進(jìn)行研究。有機(jī)氮源選擇酵母粉和尿素，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期培養(yǎng)基優(yōu)化情況，添加了5 g/L 酵母粉和3 g/L 尿素；無機(jī)氮源選擇硫酸銨和硝酸鈉，使其濃度均為0.05 mol/L。發(fā)酵60 h 之后測(cè)定菌體濃度和核黃素產(chǎn)量，結(jié)果見表1。從表1 中可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組OD600為12.4，產(chǎn)量為677 IU/mL，添加酵母粉和硫酸銨的實(shí)驗(yàn)組中菌體濃度比其他實(shí)驗(yàn)組高，相較于對(duì)照組，分別提高了35%和22%，但兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的核黃素產(chǎn)量較低；添加了尿素和硝酸鹽的實(shí)驗(yàn)組中，與對(duì)照組相比，核黃素產(chǎn)量有較明顯的增加，分別提高了15%和19%，而尿素對(duì)菌體生長的作用不明顯，硝酸鈉有一定的抑制現(xiàn)象。通過此實(shí)驗(yàn)可以推測(cè)銨鹽對(duì)于菌體生長有促進(jìn)作用，硝酸鹽對(duì)核黃素生產(chǎn)有促進(jìn)作用，在培養(yǎng)基中可尋找二者最佳配比，此比例下既有利于菌體生長又有利于核黃素生成。

表1 不同氮源對(duì)生物量以及核黃素產(chǎn)量的影響Table 1 Influence on the biomass and the yield of riboflavin under different nitrogen sources

3.2 不同質(zhì)量濃度硝酸鈉對(duì)核黃素產(chǎn)量影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）中發(fā)現(xiàn)，硝酸鹽對(duì)核黃素合成的促進(jìn)效果最明顯，因此對(duì)培養(yǎng)基中硝酸鹽的質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，搖瓶發(fā)酵60 h 后測(cè)定菌體濃度和核黃素產(chǎn)量，結(jié)果如表2 所示。在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的硝酸鈉對(duì)核黃素產(chǎn)量有不同程度提升，最高可達(dá)到832.5 IU/mL，相比于對(duì)照組的652.0 IU/mL提高了28.0%。從表中還可以看出，硝酸鈉最適質(zhì)量濃度約為10 g/L。

3.3 銨離子、硝酸根離子的混合比例對(duì)核黃素產(chǎn)量影響

為了尋找銨鹽和硝酸鹽最佳比例，首先對(duì)比枯草芽孢桿菌在利用不同無機(jī)氮源過程中的菌體濃度、核黃素產(chǎn)量、 N H+4濃度以及 N O?3濃度的變化，確定氮原子的總濃度為0.1 mol/L，設(shè)計(jì)含有不同氮源組成的培養(yǎng)基（如表3），并對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，此過程控制其他成分不變，檢測(cè)發(fā)酵過程中的pH，48 h 后測(cè)定菌體濃度和核黃素產(chǎn)量。3 種氮源對(duì)發(fā)酵影響如圖1 所示，無機(jī)氮源對(duì)pH 的影響如圖2所示。

表2 不同質(zhì)量濃度硝酸鹽對(duì)產(chǎn)量和菌體濃度的影響Table 2 Effect of different mass concentration of sodium nitrate on the yield and cell density

從圖1 中可以發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基a 中 N H+4濃度迅速下降，菌體生長速度最快，36 h 達(dá)到最大菌體濃度（OD600約為18），說明 N H+4有利于菌體的快速生成。但就核黃素產(chǎn)量而言，培養(yǎng)基a 的產(chǎn)物產(chǎn)量是3 種培養(yǎng)基中最低的。培養(yǎng)基b 中的核黃素含量比a 中的高，說明 N O?3在核黃素生產(chǎn)過程中對(duì)產(chǎn)量提升有重要作用，但菌體的生長在一定程度上卻受到抑制，生長狀況與培養(yǎng)基a 相比略顯滯后。另外在培養(yǎng)基c 的培養(yǎng)過程中， N H+4和 N O?3離子濃度同時(shí)降低，這說明了枯草芽孢桿菌對(duì) N O?3利用不受 N H+4抑制，在生長期盡管菌體比生長速率沒有培養(yǎng)基a 的高，但比僅使用NaNO3作氮源的培養(yǎng)基b 的生長情況改善明顯。從產(chǎn)量上來說，培養(yǎng)基c 的核黃素產(chǎn)量是最高的，最大產(chǎn)量為812 IU/mL，相比培養(yǎng)基a 和b，核黃素產(chǎn)量分別提高了35%和14%。

對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，銨離子在氮的代謝中具有重要作用，銨離子濃度適當(dāng)時(shí)有利于核黃素的生產(chǎn)。第一，銨離子可促進(jìn)谷氨酰胺合成，而谷氨酰胺作為三磷酸鳥苷（GTP）合成所需的物質(zhì)可促進(jìn)GTP 的生產(chǎn)，而GTP 又作為核黃素生產(chǎn)的直接前體有利于核黃素的積累。銨離子在依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的谷氨酸脫氫酶GDH（NADPH-GDH）的作用下可以與三羧酸循環(huán)（TCA）中α-酮戊二酸生成谷氨酸，接著在谷氨酰胺合成酶（GS）作用下與谷氨酸再次反應(yīng)生成谷氨酰胺[10-11]。谷氨酸合酶是由GLN1 基因編碼，在氨水平低的條件下才表達(dá)。氮源受到限制會(huì)使編碼GS 的基因去阻遏，從而激活GS 活性；當(dāng)氨水平升高時(shí)則相反[12]。文獻(xiàn)[13]研究發(fā)現(xiàn)嘌呤短缺時(shí)GS 可以去阻遏，雖然具體機(jī)理了解還不透徹，但是谷氨酰胺作為嘌呤核苷酸的前體物質(zhì)，可能影響其合成。第二，銨離子對(duì)菌體生長和異化代謝更加有利。谷氨酸含量與銨離子濃度成正相關(guān)，作為一種容易被利用的氮源，氨和谷氨酸主要通過氮代謝和糖酵解（EMP）、TCA 等途徑發(fā)揮作用，因此容易引起代謝發(fā)生遷移 ，同時(shí)也影響到依靠磷酸戊糖途徑（PP）進(jìn)行表達(dá)的核黃素的生成。從本次實(shí)驗(yàn)中也可以發(fā)現(xiàn)相似的規(guī)律：高濃度的銨離子對(duì)PP 途徑代謝會(huì)產(chǎn)生一定的抑制作用，降低核黃素產(chǎn)量，而適宜的銨離子濃度有利于核黃素生產(chǎn)。

表3 不同氮源組成的培養(yǎng)基中 N O?3 和 N H+4 的組合情況Table 3 Composition of N O?3 and N H+4 in different nitrogen sources media

圖2 無機(jī)氮源對(duì)pH 的影響Fig.2 Effect of inorganic nitrogen source on pH

硝酸鹽可以促進(jìn)核黃素生產(chǎn)的原因可分為兩個(gè)：首先，硝酸鹽作為非速效氮源，在硝酸鹽還原酶的作用下經(jīng)過一系列反應(yīng)生成氨，而被微生物所利用，這一水解速率與菌體同化速率相匹配，使銨離子的抑制效果降低，減少了代謝遷移現(xiàn)象的發(fā)生，促進(jìn)產(chǎn)物積累；其次，硝酸根離子通過影響pH 來實(shí)現(xiàn)對(duì)于菌體生長和核黃素產(chǎn)量的調(diào)控。從圖2 中可以看出，硫酸銨的加入會(huì)造成產(chǎn)酸加劇，整個(gè)發(fā)酵過程，pH 最低降至2.6，發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH 約為5。而加入部分硝酸鈉或者只添加硝酸鈉的實(shí)驗(yàn)組中，pH 比加入硫酸銨組更高，最高可達(dá)到將近7.0，該pH 條件更加適宜菌體生長和產(chǎn)物合成。NaNO3屬于生理堿性鹽，當(dāng)硝酸根作為氮源被利用時(shí)，會(huì)產(chǎn)生OH-，使環(huán)境中pH 升高，降低過度產(chǎn)酸對(duì)菌體的損害。硝酸鹽釋放的生理堿性物質(zhì)可以中和銨鹽被利用過程中產(chǎn)生的生理酸性物質(zhì)，起到維持pH 穩(wěn)定的作用，防止pH 劇烈波動(dòng)影響菌體內(nèi)酶的活性和正常生理代謝的速度。此外，根據(jù)武秋立等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，影響核黃素形成的最后一個(gè)關(guān)鍵酶（核黃素合酶）的最適pH 在微堿性范圍內(nèi)。從上述結(jié)果（圖2）可以看出，pH 對(duì)菌體生長和產(chǎn)物合成所起的作用不容忽視，具體對(duì)代謝過程中各種酶的影響有多大還有待于進(jìn)一步研究。

在保證總無機(jī)氮相等條件下，進(jìn)一步針對(duì)銨鹽和硝酸鹽的不同配比進(jìn)行過程研究，含有銨鹽比例越高，菌體生長越快，而沒有銨鹽的培養(yǎng)基中菌體生長受到一定影響，表現(xiàn)出一定的滯后性。反之，增加硝酸鹽的比例，核黃素的產(chǎn)量提高。由圖1 可得，當(dāng)硫酸銨與硝酸鈉物質(zhì)的量之比為1∶8（培養(yǎng)基c）時(shí)，核黃素的產(chǎn)量最高，為812 IU/mL，并能使菌體較快生長。

3.4 補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中銨離子濃度調(diào)控

本文初步研究了無機(jī)氮源（主要是銨鹽和硝酸鹽）的不同配比對(duì)核黃素生產(chǎn)和菌株生長的影響，并從代謝角度分析了銨鹽和硝酸鹽影響調(diào)控的內(nèi)在機(jī)制。從核黃素的結(jié)構(gòu)中可以計(jì)算出氮元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與蛋白質(zhì)平均含氮量（約16%）相近，所以在發(fā)酵過程中補(bǔ)加氮源是必要的。在工業(yè)生產(chǎn)中氨水是一種常用的無機(jī)氮源，其主要作用有兩個(gè)：一是為菌體生長和產(chǎn)物合成提供氮源，二是調(diào)節(jié)pH。

在7 L 發(fā)酵罐中采用連續(xù)補(bǔ)料的形式使葡萄糖質(zhì)量濃度維持在10 g/L 左右。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，培養(yǎng)基底料中銨離子被菌體消耗，隨著耗糖產(chǎn)酸速率增加，用于調(diào)節(jié)pH 的氨水的用量也隨之增加，從而也向發(fā)酵液中不斷引入銨離子，導(dǎo)致發(fā)酵液中銨離子濃度也隨之增加（圖3），而過高的銨離子對(duì)于核黃素生產(chǎn)不利。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因有3 個(gè)：第一，代謝流發(fā)生偏移，氨和谷氨酸在氮代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，它們作為速效氮源可以被微生物優(yōu)先利用。然而微生物同化 N H+4是一個(gè)消耗ATP 的過程，因此對(duì)能量的要求會(huì)加大，而能量的產(chǎn)生依賴碳源的利用，低的ATP 可以激活EMP 途徑關(guān)鍵酶（磷酸果糖激酶，PFK）的活性，直接導(dǎo)致EMP 途徑通量增加，用于生產(chǎn)核黃素的PP 途徑代謝通量相對(duì)減少，代謝途徑發(fā)生遷移。第二，抑制谷氨酰胺合成酶活性，降低前體物質(zhì)供應(yīng)。有研究[15-16]在鳥苷發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)高濃度的銨離子會(huì)抑制谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，該酶可以催化谷氨酸合成谷氨酰胺，它是核黃素的前體物質(zhì)之一，該物質(zhì)合成過程受阻可能會(huì)影響產(chǎn)物核黃素的形成。此外，高濃度的銨離子通過氮的代謝還會(huì)生成一些非必需氨基酸（如谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸）和有機(jī)酸（如丙酮酸）[17-18]，這些非必需氨基酸（如丙氨酸（Ala），谷氨酸（Glu））會(huì)抑制GS 活性，加劇代代謝溢流，使產(chǎn)物核黃素的生產(chǎn)速率下降，造成物質(zhì)和能量的浪費(fèi)。

圖3 氨水調(diào)節(jié)pH 對(duì)菌體濃度和產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of pH on cell density and yield by ammonia

為了避免發(fā)酵過程中銨離子濃度過高對(duì)核黃素產(chǎn)生的不利影響，本文在發(fā)酵過程中使用氨水和2 mol/L 的NaOH 交替調(diào)節(jié)pH（圖4）。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至16～18 h，銨離子濃度降至5～10 mmol/L 時(shí)，發(fā)酵過程也將這一范圍作為調(diào)控依據(jù)。當(dāng)銨離子的濃度隨著pH 的調(diào)節(jié)再次升高，超過10 mmol/L 時(shí)，改用2 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH；當(dāng)銨離子濃度低于5 mmol/L時(shí)，改用氨水調(diào)節(jié)pH，36 h 之后發(fā)酵結(jié)果如圖4 所示。將圖3與圖4 對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，調(diào)控銨離子濃度使其始終維持在比較低的水平時(shí)，核黃素產(chǎn)量由4 791 IU/mL提高至5 292 IU/mL，同時(shí)調(diào)控前后菌體濃度變化不大。

圖4 氨水和NaOH 共同調(diào)節(jié)pH 對(duì)菌體濃度和產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of pH on cell density and yield by ammonia and NaOH

4 結(jié) 論

本文首先研究了氮源種類對(duì)菌體濃度和核黃素產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：銨鹽、酵母粉可以促進(jìn)菌體生長，但卻抑制核黃素產(chǎn)量提高；尿素和硝酸鹽可明顯促進(jìn)核黃素產(chǎn)量提高，對(duì)菌體生長的作用不明顯。當(dāng)銨鹽與硝酸鹽物質(zhì)的量之比為1∶8 時(shí)，產(chǎn)量最高達(dá)到812 IU/mL，與對(duì)照組相比增加35%。

在7 L 發(fā)酵罐中pH 的調(diào)控由全部使用氨水變?yōu)橹泻笃诎彼c2 mol/L NaOH 交替使用的策略，控制銨離子濃度在10 mmol/L 以下。發(fā)酵結(jié)束后，菌體濃度沒有明顯減少，而產(chǎn)量提高10%，達(dá)到5 292 IU/mL。