mTOR信號(hào)通路相關(guān)分子在肺鱗癌組織中表達(dá)的意義

王昕晨 黃燕燕 陸暢暢 周吉航 何劍營(yíng) 方可欣 樂涵波 續(xù)力云

肺癌是全球常見的惡性腫瘤之一，在肺癌的組織學(xué)分類中，肺鱗癌占了較大比例[1]。目前肺鱗癌患者的靶向治療靶點(diǎn)非常有限[2]，因此，尋找肺鱗癌相應(yīng)的治療靶點(diǎn)成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，從酵母到哺乳動(dòng)物均廣泛存在。它作為一種主要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)分子，可以感受并結(jié)合氨基酸、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子和環(huán)境信號(hào)等，以調(diào)節(jié)細(xì)胞各個(gè)過程，包括蛋白質(zhì)合成、生長(zhǎng)、代謝、衰老、再生、自噬等。目前發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系密切，例如在宮頸癌[3]、結(jié)腸癌[4]等惡性腫瘤中表達(dá)變化明顯。本研究對(duì)mTOR信號(hào)通路相關(guān)分子在肺鱗癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征及生存期的相關(guān)性作一探討，以期為治療肺鱗癌提供新的靶點(diǎn)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2010年6月至2017年12月在本院經(jīng)手術(shù)病理檢查證實(shí)的肺鱗癌標(biāo)本共93例?；颊呤中g(shù)前均未接受放療或化療。收集患者病史資料，如年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期等。腫瘤組織學(xué)分級(jí)是以2004年WHO肺癌組織學(xué)分類為基礎(chǔ)。按照國際抗癌聯(lián)盟倡導(dǎo)的TNM進(jìn)行分類。所有標(biāo)本均經(jīng)2位病理學(xué)主任醫(yī)師明確診斷。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 mTOR抗體（1:2 000）、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）抗體（1:2 000）、P70核糖體蛋白 S6激酶（ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）抗體（1:2 000）、10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）抗體（1:25）、真核細(xì)胞翻譯起始因子 4E 結(jié)合蛋白 1（4E blinding protein1，4EBP1）抗體（1:2 400）、磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（phosphorylated 4E blinding protein1，p-4EBP1）抗體（1:2 000）均購于美國Cell signaling technology公司，磷酸化P70核糖體蛋白S6激酶（phosphorylated ribosomal protein S6 kinase，p-p70S6K）抗體（1:2 000）購于美國Santa Cruze biotechnology公司。

1.3 肺鱗癌組織中mTOR信號(hào)通路相關(guān)分子檢測(cè) 采用免疫組化方法。收集石蠟包埋組織后置于切片機(jī)中進(jìn)行連續(xù)切片。石蠟切片脫水脫蠟后，在檸檬酸緩沖液中進(jìn)行熱修復(fù)，3% H2O2室溫孵15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。正常山羊血清封閉15 min后，分別滴加相應(yīng)的抗體；另外，用PBS緩沖液替代上述抗體作為陰性對(duì)照。用免疫組化試劑盒（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行二抗孵育，DAB顯色，之后用蘇木精對(duì)玻片進(jìn)行染色，最后用樹脂封片。免疫組化結(jié)果采用雙盲顯微鏡進(jìn)行判斷。染色強(qiáng)度分為 0（無）、1（弱）、2（中）、3（強(qiáng)）。陽性細(xì)胞所占比例為 0（無染色）、1（＜1/4染色）、2（1/4～3/4染色）、3（＞3/4染色）。組織學(xué)評(píng)分是細(xì)胞陽性強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例的乘積。免疫組化染色結(jié)果分為兩組，0～2為低表達(dá)病例組，＞2為高表達(dá)病例組。如出現(xiàn)結(jié)果不一致，則由第3位病理學(xué)醫(yī)師讀片后判斷結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料的比較采用字2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法?；颊哒w生存期（OS）采用GraphPad prism 5軟件，用Kaplan-meier法進(jìn)行計(jì)算。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mTOR信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)水平與肺鱗癌臨床病理特征的關(guān)系分析 在肺鱗癌中，對(duì)mTOR信號(hào)通路分子與臨床病理特征進(jìn)行單因素分析顯示，和低表達(dá)病例組相比，4EBP1高表達(dá)病例組在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移所占比例為47.5%（29/61），而4EBP1低表達(dá)病例組在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中所占比例僅為12.5%（4/32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且4EBP1高表達(dá)病例組中分期大于域期的比例較高（P＜0.05）；而該分子的表達(dá)水平在性別、是否吸煙、癌胚抗原水平、胸膜是否侵犯、腫塊直徑大小等臨床病理特征中，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。和高表達(dá)病例組相比，PTEN低表達(dá)病例組在腫瘤直徑＞3 cm的比例較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1（插頁）；而該分子高表達(dá)在性別、是否吸煙、CEA水平、胸膜是否侵犯、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等病理特征中，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。而p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、p70s6K信號(hào)分子的表達(dá)水平在不同臨床病理特征中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。見表1。

圖1 肺鱗癌組織中10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（4EBP1）的表達(dá)（a：PTEN在肺鱗癌組織低表達(dá)；b：PTEN在肺鱗癌組織中高表達(dá)；c：4EBP1在肺鱗癌組織低表達(dá)；d：4EBP1在肺鱗癌組織高表達(dá)；DAB染色，×400）

表1 mTOR相關(guān)分子與肺鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

表1 mTOR相關(guān)分子與肺鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.2 肺鱗癌中mTOR信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)水平與生存時(shí)間的關(guān)系 與低表達(dá)病例組比較，p-mTOR信號(hào)分子高表達(dá)病例組的OS（35.0個(gè)月比75.0個(gè)月）明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2；而mTOR、p-4EBP1、4EBP1、p-p70s6K、p70s6k、PTEN 信號(hào)分子的表達(dá)與肺鱗癌患者OS均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

圖2 磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的表達(dá)與肺鱗癌患者生存期的分析

3 討論

肺癌是當(dāng)今全球常見的惡性腫瘤之一，而且近年來其在全世界的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)[5]，5年生存率僅為15%[6]，肺鱗癌又是肺癌中常見的組織學(xué)類型，隨著分子生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展，針對(duì)相應(yīng)靶點(diǎn)的分子靶向藥物已經(jīng)取得較好的療效[7]。探索肺鱗癌的分子生物學(xué)機(jī)制不僅可以提高臨床治療的效果，而且對(duì)肺鱗癌的早期診斷、臨床分期、預(yù)后判斷有著重要的作用。

mTOR編碼的大分子蛋白由2 549個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量289 kDa，其定位于人類1號(hào)染色體短臂（1p，36.2），mTOR是在分析不同啤酒酵母突變體對(duì)雷帕霉素抵抗作用的差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，在各種真核生物細(xì)胞中廣泛存在。它是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇激酶家族成員，在協(xié)調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞死亡之間的平衡中扮演著至關(guān)重要的角色[8]。近年來，mTOR信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中如乳腺癌、胃癌、肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[9-11]。

本研究中93例肺鱗癌組織分別用mTOR信號(hào)通路的 7種相關(guān)抗體（p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、4EBP1、p-p70s6K、p70s6K、PTEN）進(jìn)行免疫組化染色，通過各種抗體的表達(dá)水平探討其與腫瘤的關(guān)系。PTEN蛋白，它是一種早期發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[12]，具有磷酸酯酶的活性，可通過酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性從而抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[13]。董杰等[14]發(fā)現(xiàn)，PTEN在上皮性卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率低于卵巢良性腫瘤，玉～域期上皮性卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于芋～郁期上皮性卵巢癌組織。徐曉燕等[15]在對(duì)肺腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中PTEN蛋白的表達(dá)顯著低于正常肺組織。本研究結(jié)果表明，在腫瘤直徑＞3 cm的組織中，89.1%患者PTEN呈明顯低表達(dá)，提示PTEN的低表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)有關(guān)。

4EBP1是mTOR信號(hào)通路激活后的關(guān)鍵下游調(diào)控因子，是目前研究最為廣泛的底物[16]，相對(duì)分子量為21 000，位于染色體8 p11.23位點(diǎn)上，屬于真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eIF4E）依賴性翻譯的負(fù)調(diào)控因子家族，是促使核糖體招募mRNA的因子[17]，4EBP1通過與eIF4E結(jié)合使eIF4E的活性受到抑制，進(jìn)而抑制蛋白翻譯的起始，4EBP1磷酸化促使兩者分離，失去對(duì)eIF4E的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯的起始。朱旭明等[18]通過免疫組化法對(duì)宮頸癌的研究后發(fā)現(xiàn)，4EBP1在細(xì)胞中的染色程度、陽性細(xì)胞染色比例隨著宮頸病變程度的加重而升高。在本研究中，4EBP1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中陽性比例顯著增加，結(jié)合以上資料說明4EBP1與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)聯(lián)作用，但如何促進(jìn)轉(zhuǎn)移，需要進(jìn)一步研究。

mTOR信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子促進(jìn)惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移主要是通過其磷酸化后的活化形式進(jìn)行的，p-mTOR就是其主要的活化產(chǎn)物。Guo等[19]報(bào)道在上皮性卵巢癌（EOC）中，p-mTOR的蛋白水平明顯高于其它組，同時(shí)，p-mTOR的高表達(dá)是預(yù)測(cè)EOC患者預(yù)后不良的重要因素。Cao等[20]通過Western blot和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）以及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌組織中mTOR相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，mTOR蛋白水平的表達(dá)雖高于正常胃黏膜但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而p-mTOR在腫瘤組織中的表達(dá)比例明顯升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，mTOR信號(hào)通路被激活，主要是通過mTOR磷酸化的增加，而非去磷酸化mTOR的過表達(dá)，該學(xué)者對(duì)胃癌患者的生存期研究后亦發(fā)現(xiàn)，p-mTOR高表達(dá)與生存時(shí)間較短相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，p-mTOR高表達(dá)的患者生存期較短，這與Cao等[20]研究相符。李紅等[21]發(fā)現(xiàn)加入p-mTOR的抑制劑能夠促進(jìn)CD8+記憶細(xì)胞前體細(xì)胞的形成，獲得更多年輕化的T細(xì)胞，增加機(jī)體的免疫功能。

這些資料說明作為mTOR信號(hào)通路磷酸化后重要的活性形式，p-mTOR的過度表達(dá)在肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用，同樣作為mTOR信號(hào)通路下游分子的4EBP1，也與肺鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著重要的關(guān)系。PTEN蛋白的高表達(dá)抑制了惡性腫瘤生長(zhǎng)的能力，說明PTEN的異常表達(dá)可能在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用。而在本研究中mTOR、p-4EBP1、p-p70s6K、p70s6k這4種mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白與肺鱗癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移、患者的生存期無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與一些報(bào)道不符，這可能與樣本數(shù)過少有關(guān)，需要加大樣本量。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路與肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性，為探討其在肺鱗癌中的作用提供了臨床數(shù)據(jù)支持，將為肺鱗癌的相關(guān)研究開辟新的途徑以及尋找新的藥物作用靶點(diǎn)提供重要支持。