0 引言

肝癌為臨床高發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率逐年升高，由于患者早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時處于中晚期，往往錯過根治性手術(shù)最佳時機(jī)[1-2]。盡管肝癌的臨床診療手段日趨成熟，但患者術(shù)后五年生存率仍較低[3]。因此，尋找肝癌生物學(xué)標(biāo)志物對患者的早期診療及預(yù)后評估具有重要意義。長鏈非編碼RNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類可參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等多個層面調(diào)控的不編碼蛋白質(zhì)的RNA[4]。本研究組前期通過芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達(dá)量隨肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程變化明顯，因此，我們采用實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）進(jìn)一步驗(yàn)證其在肝癌組織中的表達(dá)，并分析了其與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月—2018年10月中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院收治的106例原發(fā)性肝癌患者，均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為肝細(xì)胞癌，且術(shù)前均未接受化學(xué)藥物及放射治療。其中，男57例，女49例；年齡38～73歲，平均年齡57.42±3.69歲；按AJCC第八版分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ期23例，Ⅱ期55例，Ⅲ期17例，Ⅳ期11例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例；腫瘤直徑1.2～9.7 cm；乙型肝炎73例（判定標(biāo)準(zhǔn)：患者血液標(biāo)本中可檢測到乙肝病毒DNA）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會審批通過，入組對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 組織樣本 術(shù)中切取肝癌及癌旁正常組織（距腫瘤組織邊緣≥2 cm，經(jīng)病理證實(shí)無癌細(xì)胞）作為檢測樣本，置于-80℃的冰箱中保存待檢。

1.2.2 試劑與儀器 TRIzol 試劑購于美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒均購于美國ABI公司，7500型qRT-PCR儀及Veriti 96孔熱循環(huán)儀購于美國ABI公司，分光光度計購于美國Bio-Rad公司。

1.2.3 總RNA提取 取4 mm3樣本組織超聲勻漿，按照TRIzol試劑盒說明書提取樣本中總RNA，經(jīng)DEPC水溶解，應(yīng)用分光光度計測定RNA的濃度和純度。另取1 μl RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，將電泳條帶清晰者用于qRT-PCR檢測。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，采用熱循環(huán)儀將長鏈非編碼RNA HOXA11-AS反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為20 μl：RNA樣品2 μl、引物1 μl、5×RT buffer 4 μl、dNTP Mixture（10 mmol/L）1 μl、U6 Reverse primer 1 μl、Reverse Transcriptase 1 μl、RNase Inhibitor 0.5 μl、RNase Free H2O 9.5 μl。反應(yīng)條件：65℃ 5 min，37℃ 2 min，5℃ 5 min，37℃ 10 min，65℃ 10 min。

1.2.5 實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)q RTPCR 應(yīng)用Primer premier 6.0軟件設(shè)計引物，并委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。長鏈非編碼RNA HOXA11-AS：上游引物序列為：5’-GCCACAUGCACCCGCCUCAGUGGUUCACA AUGGCAUCCGCUGAA-3’，下游引物序列為：5’-CAUCAGACACAGUCCACUAUGCG-3’；內(nèi)參U6引物序列為：5’-CTCGTGCAGCACAGCTC-3’（正義），5’-AGCTACAACGTATCTGTCTG-3’（反義）；長鏈非編碼RNA HOXA11-AS反轉(zhuǎn)錄引物序列為：5’-UCGUGAUCUGUCACUUCAAG CGAGAGAGCACUUAUGGCCCGCAUGCAGUG CAA-3’；內(nèi)參U6反轉(zhuǎn)錄引物序列為：5’-AATCTG GTATCCGTGCCTCTAGT-3’。按照qRT-PCR試劑盒說明書操作，采用7500型qRT-PCR儀進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，反應(yīng)體系為25 μl：已稀釋的cDNA 2 μl、引物2 μl、SYBR 12.5 μl、ddH2O 8.5 μl。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的相對表達(dá)量，以U6為內(nèi)參，?Ct=Ct長鏈非編碼RNAHOXA11-AS-CtU6。

1.3 術(shù)后隨訪

隨訪截至2019 年10 月，平均隨訪時間為（25.42±2.61）月，無失訪病例。隨訪方式主要為門診隨訪和電話隨訪，術(shù)后第一年每3月隨訪一次，第二年開始每半年隨訪一次，隨訪期內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移為病情惡化，患者死亡為隨訪終止事件。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在肝癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

檢測結(jié)果顯示，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織（2.97±0.81vs.0.83±0.22,t=26.249,P<0.001），見圖1。

圖1 長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在組織樣本中的相對表達(dá)量Figure 1 Relative expression of lncRNA HOXA11-AS in tissue samples

2.2 肝癌組織中長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在不同AJCC分期及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織中的表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見表1。

表1 長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系 ()Table 1 Relation between lncRNA HOXA11-AS expression and clinicopathological characteristics of liver cancer patients ()

表1 長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系 ()Table 1 Relation between lncRNA HOXA11-AS expression and clinicopathological characteristics of liver cancer patients ()

2.3 生存分析

隨訪期內(nèi)，106例原發(fā)性肝癌患者中51例患者病情發(fā)生惡化，其中，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS高表達(dá)（≥2.97）36例，低表達(dá)（<2.97）15例。Kaplan-Meier分析結(jié)果提示，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS高表達(dá)組1年、2年、3年生存率均明顯低于低表達(dá)組（1年：39.72%vs.62.71%,χ2=11.715,P<0.001; 2年：30.56%vs.53.33%,χ2=6.029,P<0.001; 3年：22.22%vs.53.33%,χ2=4.760,P=0.029），見圖2。為進(jìn)一步探究長鏈非編碼RNA HOXA11-AS是否為預(yù)測原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，我們進(jìn)行了單因素和多因素Cox回歸分析，結(jié)果提示，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS高表達(dá)、AJCC分期增高是影響原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素（95%CI:1.315～4.083/0.876～3.845,P=0.017/0.022）。

圖2 長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達(dá)與肝癌患者生存期的關(guān)系Figure 2 Relation between lncRNA HOXA11-AS expression and survival of liver cancer patients

3 討論

肝癌為常見的惡性腫瘤，臨床死亡率較高，由于早期癥狀較為隱匿，臨床檢出率較低[5]。因此，尋找肝癌早期診斷標(biāo)志物成為臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。長鏈非編碼RNA為不編碼蛋白質(zhì)的RNA，在發(fā)現(xiàn)初期并未獲得足夠重視，隨著臨床研究的深入，有研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA可在表觀遺傳學(xué)、基因組轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等層面上調(diào)控基因的表達(dá)[6]。最近有研究顯示，長鏈非編碼RNA在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等過程中發(fā)揮調(diào)控作用[7-8]。盡管目前在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)了多種長鏈非編碼RNA，但臨床對于長鏈非編碼RNA與肝癌的關(guān)系尚不明確。本研究組前期通過芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達(dá)量隨肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程變化明顯。因此，我們猜想長鏈非編碼RNA HOXA11-AS有可能成為臨床肝癌診療的新靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在肝癌組織中高表達(dá)，且在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。通過分析長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)其在不同AJCC分期及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織中的表達(dá)量間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果提示，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的表達(dá)與肝癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)，其可能在肝癌中發(fā)揮促癌作用。張莉等[9]對24例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移，可能成為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌治療的新靶點(diǎn)。張鴻程等[10]對13例骨肉瘤患者研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在骨肉瘤細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，且長鏈非編碼RNA HOXA11-AS的過表達(dá)可抑制骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，可能成為骨肉瘤治療潛在的分子靶標(biāo)。由此可見，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS在惡性腫瘤組織中表達(dá)異常，但其表達(dá)量在不同腫瘤中存在差異，推測這可能與腫瘤的異質(zhì)性有關(guān)[11]。

本研究進(jìn)一步分析了長鏈非編碼RNA HOXA11-AS與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA HOXA11-AS高表達(dá)組3年生存率明顯低于低表達(dá)組，結(jié)果提示，其高表達(dá)可能與肝癌患者預(yù)后不良有關(guān)。進(jìn)一步采用單因素和多因素Cox分析發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA HOXA11-AS高表達(dá)、AJCC分期增高是影響原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，提示長鏈非編碼RNA HOXA11-AS可作為肝癌患者預(yù)后的評價指標(biāo)。

綜上，肝癌組織中長鏈非編碼RNA HOXA11-AS表達(dá)上調(diào)，其可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，可成為肝癌患者預(yù)后評估的新指標(biāo)。