張世和，曹宇鑫，鄧步皓，高旭陽，趙俊星

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030800）

黃芪多糖（astragalus polysacharin，APS）提取自中藥材黃芪的根部，作為黃芪最重要的天然有效成分之一發(fā)揮作用。隨著人們對(duì)多糖研究的加深，其在抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血脂、降血糖等多方面的生物活性與功能也隨之被發(fā)現(xiàn)[1-4]。APS也因其能促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖和分化[5]以及抑制營(yíng)養(yǎng)消化和吸收酶的活性來治療肥胖癥而備受關(guān)注[6]。近年來的研究多將APS運(yùn)用于2型糖尿病、肥胖和代謝綜合征等代謝相關(guān)性疾病的防治上。

棕色脂肪（brown adipose tissue，BAT）是哺乳動(dòng)物發(fā)熱生熱的關(guān)鍵部位，其產(chǎn)生的熱量對(duì)于初生哺乳動(dòng)物在寒冷環(huán)境中的生存及冬眠動(dòng)物的體溫維持至關(guān)重要。BAT由于含有大量的線粒體以及解耦聯(lián)蛋白 1（uncoupling protein 1，UCP1）成為非寒顫性熱發(fā)生的主要組織，從而增加能量消耗[7]。近年來的研究表明，BAT能通過攝入甘油三酸酯來加速血漿脂質(zhì)的清除，從而改善血脂異常和胰島素抵抗[8]。在人和小鼠中的研究均發(fā)現(xiàn)，BAT可積極利用線粒體中的支鏈氨基酸進(jìn)行熱發(fā)生，進(jìn)而控制肥胖的發(fā)生[9-10]。因此，通過激活BAT來增加能量消耗已成為一種安全的預(yù)防和控制肥胖的方法。

長(zhǎng)鏈非編碼 RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）參與不同的生物學(xué)過程[11]，并在器官發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、凋亡和衰老[12]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs具有調(diào)節(jié)脂肪形成的能力[13-14]，并鑒定出多個(gè)與棕色脂肪發(fā)育相關(guān)的lncRNAs。lncRNA-Blnc能與早期B細(xì)胞因子2（recombinant early B-cell factor 2，EBF2）形成核糖核蛋白復(fù)合體來增強(qiáng)EBF2的表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)產(chǎn)熱基因來促進(jìn)小鼠米色和棕色脂肪細(xì)胞的分化[15]。lncBATE1能維持棕色脂肪細(xì)胞核心標(biāo)記基因的表達(dá)，抑制白色脂肪標(biāo)記基因，且能與核異質(zhì)核糖核蛋白U（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U，hnRNP U）相互作用以促進(jìn)米色和棕色脂肪的形成[16]。

本研究以小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2為研究對(duì)象，在體外培養(yǎng)的過程中添加APS，收集樣品并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，旨在揭示APS促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞C3H10T1/2分化的作用機(jī)理，并闡明lncRNAs在棕色脂肪細(xì)胞分化中的功能。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

C3H10T1/2細(xì)胞購(gòu)買自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）；達(dá)爾伯克改良伊格爾低糖培養(yǎng)液（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM，SH30021.01）購(gòu)自于 Hyclone公司；雙抗（青鏈霉素，10378016）與胎牛血清（10091155）購(gòu)自于Gibco公司；三碘甲腺原氨酸（3′-triiodothyronine，T3）、吲哚美辛、胰島素（I5500）、地塞米松（dexamethasone，Dex，D4902）和 3-異丁基 -1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-7H-xanthine，IBMX，I7018）購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司；PrimeScriptTMRT Master Mix（R047A）與 SYBR?Premix ExTaqTMII65（R820A）購(gòu)于日本TaKaRa公司。

1.2 C3H10T1/2細(xì)胞的培養(yǎng)和棕色化誘導(dǎo)

C3H10T1/2細(xì)胞種植在生長(zhǎng)培養(yǎng)基（含2%雙抗、10%胎牛血清的低糖DMEM）中，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后，分別使用未添加和添加0.4 g/L APS的分化培養(yǎng)基（0.5 mmol/L IBMX、5 μmol/L Dex、1 nmol/L T3、0.125 mmol/L 吲哚美辛和10 g/L胰島素溶于含有2%雙抗的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中）誘導(dǎo)分化，分化1.5 d后取樣用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序

以未經(jīng)APS處理的棕色脂肪細(xì)胞為對(duì)照組，經(jīng)0.4 g/L APS處理為試驗(yàn)組，每組做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，構(gòu)建6個(gè)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。上機(jī)前樣品提取總RNA后，將rRNAs去除以保留mRNAs和ncRNAs。使用片段緩沖液將得到的mRNAs和ncRNAs片段化為短片段，并用隨機(jī)引物將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。接著加入緩沖液、dNTPs（dUTP代替dTTP）、核糖核酸酶 H（ribonuclease H，RNase H）和 DNA polymerase I合成cDNA第二鏈。通過使用QiaQuick PCR試劑盒純化cDNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，并加堿基A和Illumina測(cè)序接頭。然后使用尿嘧啶-N-糖基化酶（Uracil-N-glycosylase，UNG）降解第二鏈 cDNA。通過瓊脂糖凝膠電泳選擇降解產(chǎn)物的大小，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后通過Illumina HiSeqTM4000平臺(tái)對(duì)文庫(kù)制備物進(jìn)行測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)過濾

利用 FastQC（v0.11.4）（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk...jects/fastqc/）分析了reads的堿基組成、質(zhì)量分布以及GC和AT的堿基含量。通過刪除全為A堿基、具有10%以上N堿基和質(zhì)量值（Q≤20）超過整條reads 50%的低質(zhì)量reads，來得到高質(zhì)量的reads用于后續(xù)的信息分析。

1.5 比對(duì)分析及重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本

使用reads比對(duì)工具bowtie2[17]（2.2.8）和比對(duì)軟件Tophat2[18]（2.1.1）將高質(zhì)量的reads比對(duì)到該物種的核糖體中（錯(cuò)配數(shù)：0），去掉比對(duì)上的reads后再比對(duì)到物種的參考基因組上。保留比對(duì)上的數(shù)據(jù)，使用Cufflinks[19]來重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，根據(jù)組裝出來的轉(zhuǎn)錄本在參考基因組上的位置以及篩選標(biāo)準(zhǔn)（轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度≥200 bp且exon數(shù)目≥2）篩選新的轉(zhuǎn)錄本，從而得到樣本已知的和新的轉(zhuǎn)錄本。

1.6 新lncRNAs預(yù)測(cè)

對(duì)篩選出來的新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行l(wèi)ncRNAs預(yù)測(cè)。使用CPC[20]和CNCI[21]2個(gè)軟件預(yù)測(cè)其是否具有編碼蛋白的能力，同時(shí)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)SwissProt中進(jìn)行比對(duì)，取預(yù)測(cè)無編碼能力且在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中無法比對(duì)上的轉(zhuǎn)錄本作為新lncRNA。

1.7 差異表達(dá)基因的分析

使用edgeR軟件（http://www.r-project.org/）對(duì)組間lncRNAs和mRNAs的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，利用P值與log2FC來篩選差異mRNAs轉(zhuǎn)錄本，篩選條件為P<0.05且|log2FC|>1。

1.8 GO功能注釋和KEGG通路分析

為了解lncRNAs靶基因的功能作用，我們使用基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析對(duì)其進(jìn)行了研究。GO總共有3個(gè)本體，分別描述轉(zhuǎn)錄本的分子功能、細(xì)胞組分和參與的生物過程。KEGG是分析基因在細(xì)胞中的代謝途徑的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)[22]，尤其適用于分析基因組測(cè)序和其他高通量技術(shù)，從而得到大規(guī)模的數(shù)據(jù)。

1.9 通過Real-PCR驗(yàn)證基因和lncRNAs的表達(dá)

使用Trizol?Reagent試劑盒提取總RNA，提取后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其是否降解，并用NanodropND-1000進(jìn)行濃度與完整性檢測(cè)，選取OD260nm/OD280nm為1.9～2.0者用于后續(xù)試驗(yàn)。RNA經(jīng)DNA酶處理后，取1 μg進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行qRT-PCR分析。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性20 s；95℃變性20 s，60℃退火及延伸20 s，36個(gè)循環(huán)。結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算，18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)的來源

從Illumina HiSeqTM4000平臺(tái)的每個(gè)文本庫(kù)中平均產(chǎn)生了15 177 607 700個(gè)清潔數(shù)據(jù)，在去除不符合的堿基比例和低質(zhì)量的reads后，從每個(gè)庫(kù)中平均獲得了14 831 667 631個(gè)高質(zhì)量的reads。其中，測(cè)序準(zhǔn)確率為99.9%的堿基數(shù)目占比可以達(dá)到95.19%～96.34%（表2）。在去除比對(duì)上的核糖體reads后，將其比對(duì)到小鼠的參考基因組上，有87.76%～90.65%的reads被成功定位到小鼠的參考基因組上（表2）。使用Cufflinks根據(jù)比對(duì)結(jié)果來重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，共得到了 13 450個(gè) lncRNAs和 57 776個(gè) mRNAs。使用CPC、CNCI及蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)SwissProt等工具評(píng)估新轉(zhuǎn)錄本的蛋白質(zhì)編碼潛力，并取結(jié)果相交項(xiàng)作為最終結(jié)果，我們預(yù)測(cè)出了586個(gè)新lncRNAs轉(zhuǎn)錄本（圖 1a）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time qPCR

2.2 lncRNAs數(shù)據(jù)的分布和質(zhì)量分析

根據(jù)lncRNAs在基因組上相對(duì)于蛋白編碼基因的位置，我們將lncRNAs分為5種類型，其中有13 319個(gè)為基因間區(qū)型lncRNAs，16個(gè)為雙向型lncRNAs，39個(gè)為反義 lncRNAs，63 個(gè)為正義 lncRNAs，13個(gè)為其他類型的 lncRNAs（圖 1b），基因間區(qū)lncRNAs是最常見的lncRNAs類型，其比例也最大。在所有的lncRNAs中，大多數(shù)lncRNAs具有2個(gè)外顯子（最多有27個(gè)外顯子，平均3.10個(gè)外顯子），顯著低于蛋白質(zhì)編碼基因（最多有347個(gè)外顯子，平均9.51個(gè)外顯子）（圖1c）?？傮w而言，lncRNAs的平均長(zhǎng)度為1 251.84 bp，小于mRNAs的2 615.63 bp，lncRNAs和mRNAs長(zhǎng)度的分布是一致的，相對(duì)較長(zhǎng)的mRNAs轉(zhuǎn)錄物數(shù)量高于lncRNAs（圖1d），轉(zhuǎn)錄本的平均表達(dá)值計(jì)算方法為每100萬map上的reads中map到轉(zhuǎn)錄本上的每1 000個(gè)堿基上的fragment數(shù)目（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads，F(xiàn)PKM），F(xiàn)PKM 小提琴圖表明（圖 1e），mRNAs的FPKM值為6.35，lncRNAs的FPKM值為1.75，mRNAs相對(duì)表達(dá)水平高于lncRNAs。

2.3 成對(duì)重復(fù)性檢驗(yàn)

為獲得對(duì)試驗(yàn)結(jié)果可靠性和操作穩(wěn)定性的評(píng)估，我們對(duì)2次生物學(xué)平行試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)性分析。lncRNAs的分析結(jié)果顯示，樣本間皮爾森相關(guān)系數(shù)（pearson correlation coefficient，PCC）全部大于0.990 0，最高可達(dá)到0.999 7。 mRNAs分析結(jié)果顯示，樣本間PCC全部大于0.990 0，最高為0.999 0，說明測(cè)序具有可重復(fù)性，試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和操作的穩(wěn)定性高（圖2）。

2.4 組間差異表達(dá)基因分析

依據(jù)lncRNAs和mRNAs表達(dá)的火山圖，我們發(fā)現(xiàn)了153個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs（differentially expressed lncRNAs，DElncRNAs），其中有 76 個(gè)上調(diào)，77個(gè)下調(diào)（圖3a、3c），同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了1 238個(gè)差異表達(dá)的 mRNAs（differentially expressed mRNAs，DEGs），其中有590個(gè)上調(diào)，648個(gè)下調(diào)（圖3b、3c）。隨后我們對(duì)這些DEGs進(jìn)行了GO功能注釋和KEGG分析，GO功能注釋結(jié)果顯示（圖3d），DEGs富集在了53個(gè)條目中，在3個(gè)本體的數(shù)量分布為：參與的生物過程24個(gè)、分子功能10個(gè)及細(xì)胞組分19個(gè)。參與的生物過程本體的條目主要有代謝過程、生長(zhǎng)過程、細(xì)胞過程、生殖過程、生物過程調(diào)控等，其中細(xì)胞過程富集基因最多，有734個(gè)；分子功能本體的條目有結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、分子功能調(diào)節(jié)劑、抗氧化活性等，其中結(jié)合功能富集基因最多，有645個(gè)；細(xì)胞組分本體的條目有細(xì)胞成分、突觸、核苷酸、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜部分等，其中細(xì)胞成分富集基因最多，有753個(gè)。KEGG分析顯示（圖3e），這些基因富集在了343條通路中，根據(jù)富集顯著性進(jìn)行排序，排名前20的通路為：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、酗酒、賴氨酸降解、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、皮質(zhì)醇合成與分泌、破骨細(xì)胞分化、緊密連接、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、醛固酮合成與分泌、NOD樣受體（nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR）信號(hào)通路、庫(kù)欣綜合征、甲狀旁腺激素的合成分泌及作用、基底切除修復(fù)術(shù)、脂肪酸代謝、檸檬酸循環(huán)、局灶性粘連、人類嗜T細(xì)胞病毒I型（human T-cell leukemia virus-I，HTLV-I）感染、促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥苷酸-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG）信號(hào)通路和代謝途徑。其中TNF信號(hào)通路、脂肪酸代謝和檸檬酸循環(huán)等通路能積極參與BAT細(xì)胞分化的過程。

表2 過濾前后堿基信息及比對(duì)分析統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Base information before and after filtering and comparison analysis statistics table

圖1 新lncRNAs轉(zhuǎn)錄本和數(shù)據(jù)質(zhì)量分析Fig.1 New lncRNAs transcript and data quality analysis

2.5 lncRNAs順式調(diào)控靶基因的預(yù)測(cè)

圖2 成對(duì)重復(fù)性檢驗(yàn)Fig.2 Pairwise repeatability test

以lncRNAs的上游或者下游10 kb為界定線，我們預(yù)測(cè)到了108個(gè)差異表達(dá)lncRNAs具有靶基因。靶基因GO富集分析顯示，其顯著富集的條目有32個(gè)，分別為參與的生物過程16個(gè)，細(xì)胞組分7個(gè)，分子功能9個(gè)。參與的生物過程中富集的條目有代謝過程、發(fā)育過程、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程等，其中細(xì)胞過程富集基因最多，有66個(gè)。細(xì)胞組分中富集的條目有細(xì)胞器、細(xì)胞器部分、細(xì)胞部分、細(xì)胞等，其中細(xì)胞部分和細(xì)胞器富集基因最多，都有66個(gè)。分子功能中富集的條目有核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)、催化活性，其中結(jié)合功能富集基因最多，有54個(gè)（圖4a）。KEGG分析結(jié)果顯示，靶基因富集在了66條通路中。根據(jù)KEGG氣泡圖可知，富集顯著性排名前20的通路為：安非他明成癮、胰高血糖素信號(hào)途徑、醛固酮合成與分泌、胰島素分泌、多巴胺能突觸、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)、可卡因成癮、甲狀腺激素合成、HTLV-I感染、單純皰疹感染、低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、哺乳動(dòng)物壽命調(diào)節(jié)途徑、TNF信號(hào)途徑、雌激素信號(hào)途徑、炎癥介質(zhì)對(duì)瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）通道的調(diào)節(jié)、腸免疫網(wǎng)絡(luò)用于免疫球蛋白 A（immunoglobulin A，IgA）的產(chǎn)生、原發(fā)性免疫缺陷、乙型肝炎和甲型流感（圖4b）。

2.6 lncRNAs共表達(dá)靶基因的預(yù)測(cè)

圖3 組間差異表達(dá)基因分析Fig.3 Analysis of differentially expressed genes between groups

lncRNAs共表達(dá)靶基因的GO分析結(jié)果顯示（圖5a），預(yù)測(cè)到的靶基因富集在了33個(gè)條目中。參與生物過程本體中的條目有單生物過程、細(xì)胞過程、代謝過程、對(duì)刺激的反應(yīng)等，其中細(xì)胞過程富集基因最多，有2 244個(gè)。在分子功能中的主要條目有結(jié)合、分子功能調(diào)節(jié)劑、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合等，其中結(jié)合富集基因最多，有1 491個(gè)。在細(xì)胞組分中的主要條目有細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞器部分等，其中在細(xì)胞部分富集基因最多，有2113個(gè)。

KEGG分析結(jié)果顯示，共表達(dá)基因主要參與290條代謝通路，其中和脂肪分化相關(guān)的信號(hào)通路有13條，包括cAMP信號(hào)通路、過氧化物酶體增殖物激活型受體（peroxisome proliferator activated-receptors，PPARs）信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路、胰島素分泌、脂肪酸代謝、叉頭轉(zhuǎn)錄因子（the forkhead box O，F(xiàn)OXO）信號(hào)通路、脂肪酸生物合成、脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)節(jié)、胰島素抵抗、MAPK信號(hào)通路、胰島素信號(hào)途徑、Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（the Janus kinasesignal transducer and activator of tran-ions，JAK-STAT）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3'-OH kinase/protein kinase B，PI3K-AKT）信號(hào)通路。根據(jù)Q value從小到大排序（圖5b），前20富集的通路有：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞粘附分子（cell adhesion molecule，CAMs）、嗎啡成癮、膽汁分泌、胃酸分泌、安非他明成癮、蛋白質(zhì)消化吸收、炎癥介質(zhì)對(duì)TRP通道的調(diào)節(jié)、癌癥中的蛋白多糖、谷氨酸能突觸、醛固酮合成與分泌、胰腺分泌、可卡因成癮、癌癥中的microRNAs、醛固酮調(diào)節(jié)的鈉再吸收、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、5-羥色胺能突觸、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用。

圖4 lncRNAs順式調(diào)控靶基因的預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of lncRNAs cis-regulated target genes

在共表達(dá)結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步獲得目的lncRNAs及其靶向基因，我們將DElncRNAs和DEGs之間符合PCC>0.7或PCC<-0.7且P<0.05的兩者定義為具有關(guān)系，并使用Cytoscape軟件構(gòu)建了網(wǎng)絡(luò)互作圖。根據(jù)研究結(jié)果（圖6），我們共篩選出了31個(gè)差異lncRNAs，它們與134個(gè)DEGs相關(guān)，其中 1個(gè) DElncRNA（TCONS_00027033）最多可靶向21個(gè) DEGs，1個(gè) DEG（ENSMUST00000114960）最多可與12個(gè)DElncRNAs共表達(dá)。

圖5 lncRNAs共表達(dá)靶基因的預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of lncRNAs co-expression target genes

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

為了驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本研究使用qRTPCR對(duì)隨機(jī)選擇的3個(gè)lncRNAs和3個(gè)mRNAs進(jìn)行定量驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果中FC值>1或<1分別代表基因的上調(diào)或下調(diào)和表達(dá)量的升高或降低。結(jié)果表明qRT-PCR表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致，lncRNAs（ENSMUST00000152125、ENSMUST00000191042、TCONS_00033926）及 mRNAs（ENSMUST000000109-74、ENSMUST00000031327）在熒光定量PCR與測(cè)序結(jié)果中都上調(diào)，而mRNA（ENSMUST00000165806）下調(diào)（圖7）。這證明了本次測(cè)序結(jié)果的可靠性。

圖6 DElncRNAs與DEGs的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)互作圖Fig.6 Co-expression network mapping of DElncRNAs and DEGs

圖7 差異表達(dá)lncRNAs的驗(yàn)證Fig.7 Validation of differentially expressed lncRNAs

3 討論

肥胖及其帶來的代謝類疾病已受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注。目前應(yīng)用于治療肥胖的方法包括飲食干預(yù)、運(yùn)動(dòng)治療、藥物治療及外科手術(shù)等[23]，但上述療法具有一定的局限性和副作用[24]。近年來的研究表明，BAT激活增加能量消耗可作為防治肥胖癥的潛在靶點(diǎn)，通過激活BAT增加能量消耗是一種安全預(yù)防和控制肥胖的方法[25]。在模式動(dòng)物中，增加和移植BAT能促進(jìn)脂肪代謝，減輕體重，并改善全身胰島素的敏感性[7,26]。我們前期的研究表明，APS可以促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞的成脂分化，并提高其產(chǎn)熱能力。本研究旨在闡明APS改變了C3H10T1/2分化中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜，為從lncRNAs的角度揭示APS促進(jìn)BAT細(xì)胞分化的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

RNA-seq技術(shù)的廣泛使用改變了我們對(duì)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組程度和復(fù)雜性的觀點(diǎn)。與其他方法相比，RNA-seq提供了更精確的轉(zhuǎn)錄物水平和轉(zhuǎn)錄物之間的聯(lián)系[27]，已被廣泛地應(yīng)用于 lncRNAs、micoRNAs和mRNAs等的研究中。lncRNAs的平均表達(dá)量、長(zhǎng)度、外顯子個(gè)數(shù)均要小于蛋白編碼基因[28]，這與我們的測(cè)序結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了本次測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前在lncRNAs順式靶基因預(yù)測(cè)中，選用的標(biāo)準(zhǔn)是lncRNAs上下游300 kb之內(nèi)的基因定義為相關(guān)，但多選擇100 kb[29-30]。本次試驗(yàn)我們采用了更加嚴(yán)苛的要求，篩選了上下游10 kb之內(nèi)的基因定義為相關(guān)，這增大了獲得與BAT分化相關(guān)靶基因的概率。DElncRNAs的順式及共表達(dá)預(yù)測(cè)到的靶基因GO分析中，我們發(fā)現(xiàn)順式及共表達(dá)靶基因在分子功能本體中富集的條目保持著一致，這些條目包括核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合等。這進(jìn)一步證明了lncRNAs在基因組中具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。

在對(duì)預(yù)測(cè)到的DElncRNAs順式調(diào)控靶基因進(jìn)行KEGG分析后發(fā)現(xiàn)，靶基因在胰高血糖素信號(hào)途徑中富集顯著。胰高血糖素是一種主要來源于胰島α細(xì)胞的激素，在生理上通過獨(dú)特的受體來維持葡萄糖的穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，在BAT組織的切片中直接施用胰高血糖素會(huì)增加氧氣消耗和游離脂肪酸的釋放[31]。同時(shí)，胰高血糖素對(duì)BAT細(xì)胞的刺激可以誘導(dǎo)熱量的產(chǎn)生[32]。低溫環(huán)境下發(fā)現(xiàn)，敲除胰高血糖素基因的小鼠其BAT中的生熱標(biāo)記（例如：Ucp1、Dio2和Ppargc1α）表達(dá)也在降低[33]。上述結(jié)果都證明了胰高血糖素對(duì)棕色脂肪細(xì)胞的代謝和分化具有重要的作用。外源性的APS可能通過改變相關(guān)lncRNAs的表達(dá)，調(diào)控多個(gè)處于胰高血糖素信號(hào)途徑的基因，從而影響B(tài)AT細(xì)胞的分化。在富集顯著程度居于前20的通路中，我們還發(fā)現(xiàn)胰島素分泌[34]、MAPK信號(hào)通路[35]、TNF等信號(hào)通路[36]都對(duì)BAT分化具有重要作用。在本研究結(jié)果中，前兩者信號(hào)通路中分別各有8個(gè)預(yù)測(cè)到的靶基因富集，后者有5個(gè)基因富集。綜上可知，DElncRNAs順式調(diào)控的靶基因富集于多條關(guān)于BAT分化的信號(hào)通路上的結(jié)果揭示了APS可能通過改變lncRNAs的表達(dá)來調(diào)控BAT的分化。

共表達(dá)靶基因KEGG通路分析結(jié)果表明，多個(gè)基因顯著地富集在了cAMP信號(hào)通路上。cAMP信號(hào)通路是一條調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的經(jīng)典途徑，體內(nèi)的多種激素和細(xì)胞因子都是通過此途徑來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和脂肪細(xì)胞分化的。細(xì)胞中cAMP的含量能決定蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）的活性，其能通過磷酸化2種脂質(zhì)代謝重要的酶蛋白周脂素（perilipin A）和激素敏感脂酶（hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL）來抑制脂肪細(xì)胞的分化[37]。同時(shí)細(xì)胞中cAMP濃度升高也可使磷酸二脂酶（phosphodiesterase，PDE）磷酸化從而被激活。PDE有14個(gè)亞基，分屬于7個(gè)家族[38]，其中脂肪細(xì)胞中的PDE3B的活性與脂肪細(xì)胞分化呈正相關(guān)[39]。本研究還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)靶基因富集在脂肪代謝的途徑，包括14個(gè)脂肪酸代謝，6個(gè)脂肪酸生物合成、6個(gè)不飽和脂肪酸的生物合成和6個(gè)脂肪酸降解，同時(shí)發(fā)現(xiàn)靶基因富集在了 PPAR信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路[40]、JAKSTAT信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路等與脂肪分化的相關(guān)的通路中。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，添加APS導(dǎo)致的lncRNA表達(dá)譜變化對(duì)于BAT分化具有重要影響，且這種影響涉及到多個(gè)方面，并突出地顯示了APS可能主要通過影響cAMP信號(hào)通路來加速BAT細(xì)胞的分化。

在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)互作圖結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們嘗試采用FDR<0.05且|log2FC|>1作為篩選條件進(jìn)一步縮小差異lncRNAs的范圍來獲取目的lncRNAs。篩選共得到了10個(gè)DElncRNAs。在這10個(gè)lncRNAs中，我們聚焦了1個(gè)顯著下調(diào)的lncRNA（ENSMUST00000199606），其共表達(dá)分析預(yù)測(cè)靶向基因?yàn)镋NSMUST00000209061，在對(duì)照組和處理組中表達(dá)呈顯著差異。ENSMUST00000209061基因編碼的是具有CCCH型RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域且折疊成特殊的指狀結(jié)構(gòu)的 RNA結(jié)合蛋白鋅指蛋白 36（tristetraprolin，ZFP36），其功能主要是通過與富含腺嘌呤和尿苷的mRNA 3'端結(jié)合來降解mRNA[41]。許多研究表明，ZFP36與脂肪分化及肥胖形成有關(guān)，并將其作為治療代謝疾病和肥胖的潛在靶點(diǎn)。在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中，ZFP36能通過與絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶 -1（mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1）mRNA結(jié)合來限制其表達(dá)，從而抑制脂肪細(xì)胞的分化[42]。與正常肥胖者相比，患有代謝綜合癥的肥胖者內(nèi)臟脂肪中的ZFP36的蛋白和mRNA水平降低了4～5倍，且ZFP36基因位于19q13.1長(zhǎng)臂，是個(gè)與代謝綜合征相關(guān)的區(qū)域[43]。有研究在人體中也發(fā)現(xiàn)ZFP36基因在網(wǎng)膜脂肪組織中的表達(dá)能預(yù)防胰島素抵抗和糖尿病[43]。更有趣的是，ZFP36包含許多絲氨酸和蘇氨酸，從而具備廣泛磷酸化的潛力，然而磷酸酶處理僅部分改變了蛋白質(zhì)的遷移率，表明存在其他蛋白質(zhì)修飾或與其他物質(zhì)的結(jié)合阻止了磷酸酶功能[44]。而lncRNAs很重要的功能就是對(duì)于蛋白質(zhì)的修飾，故我們猜想是lncRNA（ENSMUST0-0000199606）修飾了ZFP36，從而在脂肪分化和肥胖中起到重要作用。然而其真實(shí)的作用及具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證明。

綜上所述，本研究結(jié)果揭示了APS能影響C3H-10T1/2細(xì)胞棕色脂肪化過程中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)。靶基因預(yù)測(cè)顯示，APS可能主要通過DElncRNAs來影響包括胰高血糖素、cAMP等信號(hào)通路中的基因相對(duì)表達(dá)來促進(jìn)BAT細(xì)胞分化，同時(shí)在進(jìn)一步篩選中我們發(fā)現(xiàn)了差異lncRNA與ZFP36的關(guān)系。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究APS對(duì)BAT細(xì)胞分化的調(diào)控作用提供了科學(xué)依據(jù)。