嚴(yán) 禮，宋 晟，張繼紅，唐小蘭，張海韻，郭焜鵬

(食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，長(zhǎng)沙410117)

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種豬的急性、出血性傳染病，因其嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)，且無有效的疫苗防治，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office Inter-national des Epizooties，OIE）將其列為法定上報(bào)傳染病。我國(guó)將其列為一類傳染病，在國(guó)務(wù)院辦公廳印發(fā)的《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012－2020年）》中，非洲豬瘟是作為13種重點(diǎn)防范的外來動(dòng)物疫病之一[1-4]。非洲豬瘟于2007年4月在格魯吉亞爆發(fā)，同年11月，俄羅斯發(fā)生首例非洲豬瘟，并逐漸蔓延至俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)。2018年非洲豬瘟在我國(guó)蔓延，嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，個(gè)別省份發(fā)生大規(guī)模的生豬減產(chǎn)，并存在非洲豬瘟病死豬肉流入市場(chǎng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的病毒檢驗(yàn)方法迫在眉睫[5-9]。

微滴數(shù)字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近幾年出現(xiàn)的新一代聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)。利用油包水技術(shù)將反應(yīng)液分割為數(shù)萬個(gè)納米級(jí)大小的微滴，每一個(gè)微滴都是一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系，當(dāng)PCR擴(kuò)增完成后，利用微滴分析儀逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，再根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)中的泊松分布原理分析陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例，即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)低至單個(gè)拷貝核酸分子的絕對(duì)定量。與傳統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）方法相比，它不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，因而定量結(jié)果更為精確，同時(shí)也使體系受反應(yīng)抑制因子的影響大大降低[10-17]。

本研究根據(jù)非洲豬瘟病毒核酸的2段保守序列（VP72和K205基因），合成3對(duì)引物和探針，通過反應(yīng)條件摸索，方法優(yōu)化，比較不同引物、探針之間線性、特異性、靈敏性和重復(fù)性的優(yōu)劣，并建立非洲豬瘟病毒的ddPCR檢測(cè)方法。這有利于了解和控制非洲豬瘟疫情，也有利于嚴(yán)控非洲豬瘟病死豬肉及豬肉制品在市場(chǎng)上的銷售，切實(shí)保障人民群眾的身心健康。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒小量抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司上海]，磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司北京），非洲豬瘟檢測(cè)試劑盒（迪澳生物科技有限公司廣州），豬瘟病毒檢測(cè)試劑盒（萊普生信息科技有限公司洛陽），豬藍(lán)耳病病毒檢測(cè)試劑盒（萊普生信息科技有限公司洛陽），微滴數(shù)字PCR Supermix for Probes及微滴數(shù)字PCR相關(guān)試劑（Bio-Rad公司美國(guó)）。

1.2 儀器

QX200微滴式數(shù)字PCR儀（Bio-Rad公司美國(guó)），CFX96 Touch熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司美國(guó)）。

1.3 引物、探針與重組質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與合成

第一組引物、探針與重組質(zhì)粒：參照《OIE陸生動(dòng)物診斷與疫苗手冊(cè)》[18]非洲豬瘟qPCR檢測(cè)方法中的引物和TaqMan熒光探針序列，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。上游引物序列F為：5'-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3'；下游引物序列R為：5'-GATACCACAAGATCRGCCGT-3'；探針（Probe）為：CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG。探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)羧基熒光素（5-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM），3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)黑洞猝滅基團(tuán)（black hole quencher-1，BHQ1）。VP72序列為：CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTGGTATC。質(zhì)粒載體為pUC57。

第二組引物、探針與重組質(zhì)粒：參照T/CVMA5-2018《非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》[19]非洲豬瘟qPCR檢測(cè)方法中的引物和TaqMan熒光探針序列，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。上游引物序列F為：5'-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3'；下游引物序列R為：5'-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3'；探針（Probe）為：TATCGATAAGATTGAT。探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。VP72序列為：ATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTAC。質(zhì)粒載體為pUC57。

第三組引物、探針與重組質(zhì)粒：參照鄔旭龍等[11]的《非洲豬瘟病毒微滴數(shù)字PCR（ddPCR）方法的建立及應(yīng)用》非洲豬瘟qPCR檢測(cè)方法中的引物和TaqMan熒光探針序列，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。上游引物序列F為：5'-CAGGCAAAACAAGTGAAACA-3'；下游引物序列R為：5'-GCAAACTGCTCATCCAATAT-3'；探針（Probe）為：TGTTCTTCACGCGTAGCGAATGGGC。探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。K205序列為：CAGGCAAAACAAGTGAAAC-ACCTAAAAAAAATCCCACGAATGCAATGTTCTTCACGCGTAGCGAATGGGCATCCTCGAAAACTTTTCGAGAAAAGTTTTTAACACCAGAAATTCAGGCCATATTGGATGAGCAGTTTGC。質(zhì)粒載體為pUC57。

1.4 微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系及條件

微滴數(shù)字PCR設(shè)置上、下游引物各1 μL（濃度為 500 nmol/L），探針 0.5 μL（濃度為 250 nmol/L），ddPCR Super mix for Probes 10 μL，DNA 模板 5 μL，加 ddH2O至20 μL。利用 Bio-Rad QX100數(shù)字 PCR微滴生成儀將20 μL體系混合物合成微滴，再利用Bio-Rad T100 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。ddPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min，94 ℃變性 30 s，50～60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)，98℃微滴固化10 min，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用Bio-Rad QX200微滴分析儀讀取DNA拷貝數(shù)。

1.5 特異性試驗(yàn)

以豬瘟病毒（classical swine fever virus，CFSV）和豬藍(lán)耳病病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）的保守序列重組質(zhì)粒為模板，用非洲豬瘟病毒微滴數(shù)字PCR試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估該方法的特異性。

1.6 方法檢出限、線性范圍與重復(fù)性試驗(yàn)

將重組質(zhì)粒以10倍的梯度進(jìn)行稀釋，取5 μL作為模板DNA進(jìn)行ddPCR和qPCR檢測(cè)，每個(gè)梯度質(zhì)粒含量分別為 0.1、1.0、10.0、100.0、500.0 fg，每個(gè)梯度做3次平行檢測(cè)。評(píng)估方法的檢出限、線性及重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 非洲豬瘟病毒微滴數(shù)字PCR方法的優(yōu)化

設(shè)置 60、59、58、56、54、52、51、50 ℃梯度的退火溫度，從左至右，藍(lán)色微滴顯示為陽性微滴。引物探針1的退火溫度越低陽性微滴熒光信號(hào)越強(qiáng)；引物探針2的陽性微滴熒光信受退火溫度影響不明顯；引物探針3的退火溫度越低，陽性微滴熒光信號(hào)越低。綜合這3組引物探針的擴(kuò)增效果，本研究最終選擇了58℃作為退火溫度。

在以此確定的反應(yīng)條件下，引物探針1的陰陽性微滴劃分閾值劃定在熒光強(qiáng)度為1 000的位置，引物探針2和引物探針3的陰陽性微滴劃分閾值均劃定在熒光強(qiáng)度為2 000的位置（圖1）。

2.2 ddPCR檢測(cè)方法特異性

3對(duì)引物、探針均采用CFSV重組質(zhì)粒、PRRSV重組質(zhì)粒及蒸餾水對(duì)ddPCR檢測(cè)方法的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，均無顯著非特異性擴(kuò)增，表明非洲豬瘟ddPCR檢測(cè)方法具有良好的特異性（圖2）。引物探針1的假陽性率為每反應(yīng)0.4個(gè)陽性微滴；引物探針2的假陽性率為每反應(yīng)0.0個(gè)陽性微滴；引物探針3的假陽性率為每反應(yīng)0.6個(gè)陽性微滴。由于假陽性為小概率事件，所以根據(jù)泊松分布建立模型，以假陽性率估計(jì)得到的引物探針1的空白限（limit of blank，LoB）為1拷貝ASFV基因，引物探針2的空白限為0拷貝ASFV基因，引物探針3的空白限為2拷貝ASFV基因。單個(gè)反應(yīng)體系中待測(cè)樣本濃度低于空白限以下為檢測(cè)灰區(qū)，無法判定陰陽性，且各引物探針的檢出限必須高于空白限且存在顯著差異。

2.3 ddPCR檢測(cè)方法靈敏度與線性范圍

將重組質(zhì)粒以10倍的梯度進(jìn)行稀釋，并配置PCR反應(yīng)體系，得到終質(zhì)量濃度分別為0.1～500 fg/反應(yīng)的樣品，而后進(jìn)行ddPCR檢測(cè)。所有ddPCR反應(yīng)生成的微滴數(shù)目均大于10 000滴，表明所有反應(yīng)微滴均正常生成，保證了后續(xù)定量分析的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)表明，ddPCR的檢測(cè)范圍是101～106拷貝數(shù)/反應(yīng)，所有檢出限均高于空白限，結(jié)果可靠，其中引物探針3的檢測(cè)線最低，為2.73拷貝數(shù)/反應(yīng)（表1）。從根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中可發(fā)現(xiàn)，樣品DNA濃度在101～106拷貝數(shù)/反應(yīng)之間時(shí)，ddPCR檢測(cè)結(jié)果呈良好的線性關(guān)系，3組引物探針的R2都大于0.990 0，適合定量檢測(cè)的需要（圖3）。

2.4 ddPCR檢測(cè)方法重復(fù)性

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，3組引物探針在0.1 fg/反應(yīng)質(zhì)量濃度下檢測(cè)變異系數(shù)較高（36.09～117.22），而在質(zhì)粒的質(zhì)量濃度為1～500 fg/反應(yīng)范圍內(nèi)，3組引物探針檢測(cè)變異系數(shù)均低于15，具有良好重復(fù)性，因此定量質(zhì)粒的質(zhì)量濃度范圍為1～500 fg/反應(yīng)（表2）。

表1 非洲豬瘟ddPCR和qPCR檢測(cè)檢出限比較Tab.1 Comparative detection limit of the ASFV ddPCR and qPCR assays

圖1 非洲豬瘟病毒微滴數(shù)字PCR退火溫度條件Fig.1 Temperature conditions of African swine fever virus droplet digital PCR

圖2 ddPCR非洲豬瘟病毒方法特異性試驗(yàn)Fig.2 Specificity of African swine fever virus ddPCR method

圖3 ddPCR非洲豬瘟病毒方法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of African swine fever virus ddPCR method

表2 非洲豬瘟ddPCR重復(fù)性試驗(yàn)Tab.2 Repeatability of ASFV ddPCR

3 討論

隨著非洲豬瘟于2018年在我國(guó)被發(fā)現(xiàn)，至今已在全國(guó)形成了一定的污染面。養(yǎng)豬場(chǎng)戶的防疫意識(shí)普遍薄弱，防疫水平整體低下，清洗消毒措施難以完全落實(shí)到位，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)疫情傳播風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)存在，同時(shí)還存在帶非洲豬瘟病毒的豬肉流入食品生產(chǎn)加工領(lǐng)域的風(fēng)險(xiǎn)。而建立一種靈敏度更好、準(zhǔn)確性更高、抗干擾能力更強(qiáng)并且能避免假陰性與假陽性的非洲豬瘟病毒檢測(cè)方法能更及時(shí)地發(fā)現(xiàn)潛在風(fēng)險(xiǎn)，既有利于非洲豬瘟疫情“早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告、早處置”，也有利于降低運(yùn)輸、屠宰、生產(chǎn)加工等下游環(huán)節(jié)疫情傳播風(fēng)險(xiǎn)，更有利于有效防范非洲豬瘟豬肉進(jìn)入食品加工環(huán)節(jié)。目前運(yùn)用最廣的ASFV檢測(cè)技術(shù)是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organization for Animal Health，OIE）和聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）推薦的紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（用于病毒分離）、直接免疫熒光試驗(yàn)、免疫酶組化試驗(yàn)、夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（用于檢測(cè)病毒抗原）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、qPCR以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）（用于檢測(cè)病毒核酸）。我國(guó)針對(duì)ASF的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)分別制定了一個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《非洲豬瘟診斷技術(shù)》GB/T 18648-2002[20]、一個(gè)商檢行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范》SN/T 1559-2010[21]和一個(gè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》T/CVMA 5-2018[19]。其中最為常用的檢測(cè)技術(shù)是qPCR，但該技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量，在實(shí)際工作中可能出現(xiàn)假陰性與假陽性結(jié)果，給非洲豬瘟疫情的防疫工作帶來極大的不便。而ddPCR作為一種新的定量檢測(cè)技術(shù)已廣泛運(yùn)用到分子生物學(xué)檢測(cè)中，具有較好的特異性與準(zhǔn)確性，理論上可以精確到單個(gè)病毒核酸的檢測(cè)，能有效避免qPCR檢測(cè)所遇到的假陰性、假陽性問題，極大地提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。原霖等[10]、鄔旭龍等[11]開展了非洲豬瘟病毒的ddPCR相關(guān)研究工作，但尚未廣泛推廣應(yīng)用到ASFV的檢測(cè)中，尤其是預(yù)包裝食品領(lǐng)域仍未見相關(guān)報(bào)道。本文根據(jù)非洲豬瘟病毒核酸的2段保守序列（VP72和K205基因），合成3對(duì)引物和探針，摸索條件，優(yōu)化方法，并比較方法的線性、特異性、靈敏性和重復(fù)性。結(jié)果表明，這3種方法的檢出限均小于6拷貝數(shù)/反應(yīng)，在10～106拷貝數(shù)/反應(yīng)之間呈良好的線性關(guān)系，定量范圍內(nèi)的檢測(cè)變異系數(shù)均低于15%，重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，能滿足快速定量檢測(cè)的要求。在后續(xù)工作中，這3種方法將進(jìn)一步推廣應(yīng)用到生鮮肉、冷卻肉、腌臘肉、醬鹵肉、油炸肉、火腿、肉干、肉鋪等豬肉制品中，爭(zhēng)取在源頭、食品加工、食品銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)中加強(qiáng)生鮮豬肉及各類豬肉制品中非洲豬瘟病毒的檢測(cè)，切實(shí)降低潛在風(fēng)險(xiǎn)。