雷 平，黃 軍，黃彬彬，畢世宇，郭照輝，劉清術，唐 瀅*

（1.湖南省微生物研究院，長沙410009；2.湖南省農(nóng)用微生物應用工程技術研究中心，長沙410009）

我國是世界第一大辣椒生產(chǎn)國與消費國，年播種面積約133萬公頃[1]。但是在辣椒種植上普遍存在盲目施肥和過度施肥的現(xiàn)象，大量化肥的施用導致土壤板結及肥力下降，最終造成辣椒產(chǎn)量和品質的下降，這一現(xiàn)象已經(jīng)影響到我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。

過量施用化肥會造成肥料利用率低、生態(tài)環(huán)境惡化等一系列問題。因此，能替代化肥的新型安全高效肥料的研制迫在眉睫。擁有多種促生功能且性能穩(wěn)定的生物有機肥的研發(fā)及應用具有重要的研究意義和廣闊的市場前景[3]。生物有機肥中的菌株來源于土壤或植物材料，對環(huán)境無毒無害，施用后可以改良土壤，增加土壤有機質的含量，還可促進作物的生長發(fā)育，從而起到提高產(chǎn)量和改善品質的作用[4-5]。

內(nèi)生菌作為一類未被完全發(fā)掘的微生物資源，近年已成為植物促生抗病微生物篩選的熱點。篩選和利用辣椒內(nèi)生菌來防治植物病害的研究已經(jīng)有大量報道[6-8]，本課題組前期也分離篩選了大量內(nèi)生菌資源，主要集中在芽孢桿菌（Bacillus）和鏈霉菌（Streptomyces）2大類[9-10]。關于辣椒內(nèi)生菌的促生長研究還不太多，特別是假單胞菌（Pseudomonas）作為植物內(nèi)生菌對辣椒促生長的報道很少。本研究從湖南省辣椒主栽品種興蔬215中分離到1株產(chǎn)鐵載體的內(nèi)生假單胞菌PEB40，該菌株能在鉻天青（chrome azurol S，CAS）平板上產(chǎn)生較大的噬鐵圈，同時還具備產(chǎn)生吲哚 -3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、溶磷、解鉀、固氮等能力，盆栽試驗中亦顯示出很好的促生長效果，其分子生物學分類鑒定及形態(tài)特征表明該菌很可能為假單胞菌屬的1個新種。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2017年湖南省農(nóng)科院蔬菜所常年種植辣椒的試驗田內(nèi)采集的辣椒健康植株，其品種為興蔬215。將植株根上的土用力抖落，用無菌剪刀剪下其根系置于冷藏盒中，帶回實驗室后進行根系微生物分離。

常規(guī)細菌的分離培養(yǎng)采用LB（Luria-Bertani）和1/10 LB培養(yǎng)基。其液體培養(yǎng)基的成分為：蛋白胨10 g、牛肉浸膏10 g、氯化鈉 3 g、蒸餾水 1 000 mL，pH值為6.5±0.5（25℃）。將LB液體培養(yǎng)基稀釋10倍，并調(diào)節(jié)pH值至6.5±0.5（25℃）即為1/10 LB液體培養(yǎng)基。在相應液體培養(yǎng)基中加入1.8%～2.3%瓊脂粉即得固體培養(yǎng)基。

本文采用CAS平板檢測細菌產(chǎn)鐵載體的情況，具體配置參考榮良燕等[11]的研究中的方法，稍有調(diào)整。首先配置溶液I：60.5 mg CAS溶于50 mL超純水中，與10 mL Fe3+溶液混合，加入到十六烷基三甲基溴化胺（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，HTAB）溶液中。再配溶液II，其組分為：KH2PO40.3 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1.0 g、瓊脂粉 15 g、呱嗪二乙酸磺酸鈉（Pipes）30.24 g，pH 6.8。20%蔗糖溶液、10%酸水解酪素、1 mmol/L CaCl2和10 mmol/L MgSO4分別單獨滅菌，待冷卻至50℃，按比率混合后傾注至平板上。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒內(nèi)生細菌的分離

內(nèi)生菌的分離參考袁珊珊[12]的方法，并進行了細微的調(diào)整。將田間采集的辣椒主根及側根剪下，用自來水洗凈泥沙，放入超凈工作臺中吹干根表水分；然后將根系剪成小段，放入Na2HPO4溶液中進行超聲，進一步去除根系表面的雜質；取出根系依次用無水乙醇、4%次氯酸鈉溶液、硫代硫酸鈉溶液進行表面消毒，消毒后用大量無菌超純水洗去殘留的消毒劑；取最后一次清洗液涂布于無菌LB平板上檢測根系表面消毒是否徹底；將表面消毒徹底的根系置于超凈工作臺中吹干并放入無菌研缽中，加入適量無菌水研磨成漿液，取1、10、50 μL分別涂布于LB和1/10 LB平板上，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d，挑取單菌落劃線至LB平板上，經(jīng)過多次劃線分離，最終獲得菌落形態(tài)一致的純培養(yǎng)細菌菌落。

1.2.2 根系內(nèi)生菌產(chǎn)鐵載體能力的測定

采用CAS平板法對細菌的產(chǎn)鐵載體能力進行測定[11]。將上述分離到的辣椒內(nèi)生菌株接種到LB平板上培養(yǎng)24～36 h后，采用點接種法，用滅菌的牙簽將菌種接在CAS固體檢測平板上，每個菌種3個重復，置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～7 d。觀察菌落周圍是否產(chǎn)生黃色暈圈，即噬鐵圈，并測定黃色透明圈的直徑。選擇暈圈直徑大小在（5.0±0.5）mm且在LB培養(yǎng)基中菌落呈淺黃綠色、表面光滑、無芽胞、桿狀的革蘭氏陰性細菌進行后續(xù)試驗。

1.2.3 內(nèi)生菌PEB40促進植物生長指標的檢測

為檢測內(nèi)生菌PEB40除了產(chǎn)生鐵載體之外，是否還具備其他促進植物生長的潛力，我們根據(jù)文獻報道的方法[13-14]，對其進行了產(chǎn)IAA、溶解有機磷、無機磷、解鉀及固氮等能力的測定。

1.2.4 內(nèi)生菌PEB40的16S rDNA序列測定及初步菌種鑒定

根據(jù)前期建立的方法[9-10]進行菌種鑒定，具體如下：挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后收集菌液，用無菌水洗滌1次后，取1 μL菌懸液作為模板，用細菌通用的16S rDNA擴增引物27F/1492R擴增待測菌株16S rDNA。菌落PCR擴增體系為：PCR Mix 25 μL、引物 27F（10 μmol/L）1 μL、引物 1492R（10 μmol/L）1 μL、模板 1 μL，加重蒸水至 50 μL。擴增條件為：98 ℃ 10 min，98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃35 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。采用DNA膠回收試劑盒，通過瓊脂糖凝膠電泳回收目標DNA片段，送湖南擎科生物技術有限公司測序。測序結果用Ez-BioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）進行在線分析[15]，選取同源性在98.39%至95.35%的假單胞菌屬的模式菌株進行Clustal Omega多序列比對，利用軟件Mega X構建系統(tǒng)進化樹，采用自舉法（Bootstrap）評估分支可信度，Bootstrap取樣值大于1 000。

1.2.5 產(chǎn)鐵載體菌株的促生長田間小區(qū)試驗

活化假單胞菌PEB40，并接種于LB液體培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期得到種子液。種子液按2%的接種量轉接于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min震蕩培養(yǎng) 40～48 h得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液倒出后，通過平板計數(shù)的方式計算發(fā)酵液中的有效活菌數(shù)。菌液離心后棄去上清，用水將發(fā)酵液稀釋成菌液濃度為108CFU/mL的溶液，用于辣椒盆栽試驗。盆栽試驗設置2個組，即空白組（check，CK）、處理組（PEB40），每組種植 20株，盆栽土壤采用取自田間的菜地土，每盆裝2 kg。移栽前，處理組的辣椒苗用PEB40菌液浸根處理30 s，而后每10 d對辣椒植株澆灌1次制備的菌劑（菌液濃度為108CFU/mL），菌劑用量為每株10 mL，共澆灌3次；空白組用清水替代菌劑進行浸根處理和辣椒植株的澆灌，處理組和對照組的其他水肥管理條件完全相同，按農(nóng)民慣用的施肥用量進行施肥，統(tǒng)一不使用防治病害的藥劑。種植50 d后，觀察辣椒的生長情況，記錄株高和展幅等指標，統(tǒng)計辣椒植株從開始結果到有效采收期（50 d）內(nèi)所有成熟辣椒的鮮重，結果數(shù)是采收辣椒的總數(shù)量。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)鐵載體內(nèi)生菌的分離和篩選結果

本文從辣椒根系樣品中分離到內(nèi)生細菌52株。將這些菌株分別點接到CAS平板上，其中7株內(nèi)生菌能產(chǎn)生不同大小的黃色噬鐵圈，分別為PEB5、PEB5、PEB15、PEB21、PEB23、PEB40、PEB73、PEB99，表明這些菌株能產(chǎn)生鐵載體以螯合培養(yǎng)基中的鐵（表1）。本研究對各菌株產(chǎn)生的噬鐵圈大小進行了測定，通過比較噬鐵圈大小發(fā)現(xiàn)，PEB40菌株產(chǎn)生的噬鐵圈最大，半徑為（5.0±0.5）mm，如圖 1a所示，因此我們選取該菌株進行后續(xù)的促生長試驗。

表1 不同辣椒內(nèi)生菌產(chǎn)鐵載體能力測定Tab.1 CAS assay for analysis of siderophores produced by different capscium endophytes

2.2 產(chǎn)鐵載體內(nèi)生菌PEB40的形態(tài)學觀測

經(jīng)革蘭氏染色，PEB40菌體在顯微鏡下呈現(xiàn)紅色，推測其應為革蘭氏陰性菌。同時其菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，不形成芽孢（圖1b）。在LB固體培養(yǎng)基上，PEB40菌株形成的菌落呈淡黃色（圖1c）。

2.3 產(chǎn)鐵載體內(nèi)生菌PEB40促進植物生長潛能的測定

內(nèi)生菌PEB40產(chǎn)IAA、溶磷、解鉀、固氮等能力測定結果顯示，其除了能產(chǎn)生鐵載體外，還能在添加色氨酸的情況下產(chǎn)生植物生長激素IAA。此外，該菌還能在以有機磷為唯一磷源的測定培養(yǎng)基上產(chǎn)生較大的透明水解圈，說明其具有較強的溶解有機磷的能力。在以無機磷為唯一磷源的培養(yǎng)基上亦能產(chǎn)生水解圈。該菌也可在鉀長石和阿須貝無氮培養(yǎng)基上很好地生長，說明其可能還具有解鉀和固氮能力，詳見表2。因此，內(nèi)生菌PEB40具有較大的促進植物生長的潛力。

2.4 內(nèi)生菌PEB40對辣椒的促生長效果

本文采用盆栽試驗測定了PEB40菌株對辣椒的促生長效果。從表3中可看出，處理組的辣椒植株比對照組長勢更茂盛，處理50 d后，辣椒的結果數(shù)、產(chǎn)量、株高、展幅與空白組相比，各指標均存在顯著的優(yōu)勢（P＜0.05），其中株高增加了18.9%，展幅增加了20.7%，產(chǎn)量增加了35.3%。這表明產(chǎn)鐵載體內(nèi)生菌PEB40對辣椒具有明顯的促生長效果，具有開發(fā)為微生物肥料的潛力。

圖1 PEB40菌株Fig.1 Strain PEB40

表2 內(nèi)生菌PEB40促生指標測定Tab.2 Detection of the plant-promoting ability of endophytic bacteria PEB40

2.5 產(chǎn)鐵載體內(nèi)生菌PEB40的16S rDNA序列分析及初步鑒定

16S rRNA基因序列同源性為細菌新種鑒定的重要指標之一。微生物分類學界權威人士，EzBio-Cloud創(chuàng)始人、首爾大學教授Chan[16]報道，98.7%為判定新種的分界點。微生物分類學權威雜志International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology（IJSEM）上發(fā)表的新種，其最高同源性也在該范圍內(nèi)[17]。以PEB40的基因組為模板，27F/1492R為引物，成功擴增到了1.5 kb左右的條帶，切膠純化后進行測序，將所得序列提交至GenBank（ID:MT703-863），并與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中的模式菌株進行比對。比對結果顯示與該菌16S rDNA同源性最高的菌株為硝基還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducensDSM 14399），同源性為98.38%，低于閾值（98.7%）。將該16S rDNA序列與假單胞菌屬（Pseudomonas）的代表菌株進行多序列比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），從中可看出，PEB40與硝基還原假單胞菌（P.nitroreducens）DSM 14399在進化樹上位于不同分支，分支處Bootstrap值為91，可信度高，且距離較遠，為新種可能性大。菌株、菌落形態(tài)特征表明PEB40應為假單胞菌屬的菌株。

表3 內(nèi)生菌PEB40對辣椒的促生長效果Tab.3 Growth promotion effect of endophyte PEB40 on capscium

圖2 內(nèi)生菌PEB40的16S rDNA進化樹(鄰位法)Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree of the endopytic bacterium PEB40 based on its 16S rRNA gene sequence

3 討論

關于辣椒內(nèi)生菌分離的研究報道較多，主要集中在辣椒病害拮抗菌的篩選上。已報道的辣椒促生長菌株主要為根際促生長菌株（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR），而對于從內(nèi)生菌中篩選促進植物生長的微生物菌株并不多見[6-10]。內(nèi)生菌具有較強的定植和靶向能力，在施入土壤后，能通過根系進入植物體內(nèi)實現(xiàn)穩(wěn)定的定植，并行使相關功能，因此，內(nèi)生菌相比于土壤及根際微生物而言，將更有優(yōu)勢[18-20]。本研究從多年種植辣椒的基地采集了健康植株的根系，表面消毒后從根系中分離到1株內(nèi)生細菌PEB40，該菌株能在CAS平板上產(chǎn)生較大的噬鐵圈，還具有較好的產(chǎn)IAA和溶解有機磷的能力，顯示了很好的植物促生長潛能。盆栽試驗顯示，PEB40菌株對辣椒具有顯著的促生長效果，施用該菌劑后，辣椒的結果數(shù)、產(chǎn)量、株高、展幅與空白組相比均存在顯著的優(yōu)勢（P＜0.05），具有開發(fā)為微生物肥料的潛力。經(jīng)16S rDNA序列及進化樹分析，PEB40很可能是假單菌屬的一個新種，與其同源性最高的菌株為硝基還原假單胞菌（P.nitroreducens）DSM 14399。

鐵在地殼中含量豐富，但中性pH下，可溶性游離鐵離子的濃度僅為10-10～10-9mol/L，遠達不到生物體能利用的濃度（10-7～10-5mol/L）[21]。鐵載體能螯合環(huán)境中的鐵離子，將其轉化為生物體可利用的形式。植物能從其自身及其他微生物的鐵載體中獲取鐵離子，有些植物甚至能夠通過分泌酚類物質調(diào)節(jié)根際微生物群落，使能產(chǎn)生鐵載體的微生物的豐度增加。多篇報道亦表明假單胞菌屬（Pseudomonas）和鏈霉菌屬（Streptomyces）的多株細菌能夠通過產(chǎn)生鐵載體促進植物生長[22-23]。此外，根際細菌產(chǎn)生的鐵載體也可以通過與植物病原菌競爭鐵離子，進而抑制其生長，提高植物的抗病能力[24]。鐵載體還可以螯合許多有害的金屬離子，如 Cr3+、Al3+、Cu2+、Eu3+、Pb2+等，改善土壤理化性質[25]。部分有益根際微生物亦可定植于植物體內(nèi)成為內(nèi)生菌。內(nèi)生菌PEB40具有較強的產(chǎn)鐵載體能力及促生性能，然而其中的機理仍有待進一步研究。接下來，我們將深入研究菌株PEB40對土壤理化性質及根際微生物群落結構的影響，進行生理生化及化學成分分析以完善該菌的新種鑒定工作，繼續(xù)開展PEB40菌株的生物安全性評價、高水平發(fā)酵工藝以及與其他微生物肥料功能菌株的復配工藝、田間施用技術等，推動將PEB40菌株作為新微生物肥料生產(chǎn)菌株的開發(fā)和應用。