武曉英，李 博，吳麗華，曹貴東，喬宏萍*

（1.太原師范學(xué)院生物系，晉中 030619；2.山西瑞象生物藥業(yè)有限公司，太原 030032）

砷中毒是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，包括我國在內(nèi)的世界許多國家地下水砷的含量都嚴(yán)重超標(biāo)[1-3]，山西屬于高砷地下水分布區(qū)[4-5]。鑒于砷對生物組織、器官的毒害作用[6-9]，國際癌癥研究中心已將砷確定為人類致癌物[10-11]。砷的毒性研究主要集中在氧化損傷和細(xì)胞凋亡方面[12-14]，其可以誘導(dǎo)生物產(chǎn)生活性氧來破壞機體的抗氧化系統(tǒng)，從而引發(fā)組織損傷、機體炎癥以及細(xì)胞凋亡[15-16]。砷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡已被廣泛研究，已有的研究表明，砷可通過氧化損傷誘導(dǎo)人的腎小管上皮細(xì)胞（human renal tubular epithelial cell，HK-2）凋亡[17]。近年來，從天然產(chǎn)物中篩選、開發(fā)抗氧化劑已成為新的研究熱點。玫瑰花（Rosa rugosa）因其高的藥食兩用價值被載入《食物本草》中，除具有較強的抗氧化、抗癌、抗菌和抗病毒等生理活性外，還可以有效降低細(xì)胞的氧化損傷[18-20]。因此，該試驗以模式生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為對象，在砷脅迫下誘導(dǎo)酵母細(xì)胞氧化損傷，通過添加玫瑰提取物（rose extract，RE），以抗壞血酸（ascorbic acid，Vc）作為對照，揭示了 RE對酵母細(xì)胞的抗氧化作用機制，為治療人類疾病提供了一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與試驗材料

試驗分6組，分別為釀酒酵母/對照組（control group，C組）、釀酒酵母 +1.5 g/L RE培養(yǎng)組（RE組）、釀酒酵母+0.1 g/L Vc培養(yǎng)組（Vc組）、釀酒酵母+1.0 mmol/L 亞砷酸鈉（sodium arsenite，As）培養(yǎng)組（As組）、釀酒酵母+As+RE培養(yǎng)組（As+RE組）和釀酒酵母+As+Vc培養(yǎng)組（As+Vc組）。

干制苦水玫瑰花50 g，產(chǎn)地甘肅，購自同仁堂藥店。釀酒酵母GGMCC2.1882購自中國科學(xué)院研究所菌種保藏中心。

1.2 RE的制備

將玫瑰花粉碎稱取50 g，加90%乙醇浸泡過夜，采用乙醇加熱回流法提取玫瑰花的粗提物，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2 g/mL，100℃間歇性滅菌后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Vc、RE清除DPPH的半抑制量計算

Vc 取 0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 g/L 6 個質(zhì)量濃度梯度，RE 取 0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g/L 6個質(zhì)量濃度梯度，每個質(zhì)量濃度設(shè)置3個重復(fù)，分別加入質(zhì)量濃度為0.03 g/L的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH），利用OD517nm的吸光度值計算 Vc和RE DPPH（南京建成生物工程研究所，南京）的清除率，用Vc和RE的含量（X axis，X）對DPPH的清除率（Y axis，Y）做散點圖，進(jìn)一步做出線性方程。試驗中RE和Vc的添加以50%DPPH清除率為標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 不同濃度砷脅迫下酵母細(xì)胞的生長曲線測定

在酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）中分別加入 0.0、0.5、1.0和2.0 mmol/L的As；取相同體積對數(shù)生長期酵母細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)期為24 h，每隔2 h連續(xù)測定OD600nm的值；繪制橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間，縱坐標(biāo)為OD600nm吸光度值的酵母生長曲線，通過酵母細(xì)胞的生長曲線選擇砷脅迫酵母的添加濃度。

1.5 RE對砷脅迫下酵母細(xì)胞生長抑制率和噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖的影響

生長抑制率：取對數(shù)期相同體積的經(jīng)活化的酵母細(xì)胞菌懸液，按照6個不同處理組進(jìn)行培養(yǎng)，每個處理組重復(fù)3個樣本，150 r/min、28℃連續(xù)恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后測定OD600nm的值，以C組的OD值為對照組參數(shù)，其他組OD值為處理組，計算每組生長抑制率公式為：生長抑制率（%）=（1-OD處理/OD對照）×100%。

噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）細(xì)胞增殖檢測：培養(yǎng)24 h后的不同處理組酵母細(xì)胞同時進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖檢測，檢測方法按照南京建成生物工程研究所MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）的說明進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測吸光度值。

1.6 酵母細(xì)胞的存活率檢測

將不同處理組中過夜培養(yǎng)的酵母菌分別稀釋100、101、102、103和 104倍，各取 5 μL 滴于 YPD 固體平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h、48 h后觀察菌落的生長情況。

1.7 酵母細(xì)胞的FDA/PI染色法

不同處理組分別取1 mL過夜培養(yǎng)的酵母菌，用 1 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）反復(fù)洗滌2次后離心收集細(xì)胞，在酵母細(xì)胞中加入熒光素二乙酸/碘化丙錠（fluorescein diacetate/propidium lodide，F(xiàn)DA/PI）染色液（Sigma corporation，美國），振蕩搖勻后，在室溫下進(jìn)行避光反應(yīng)10 min，吸取5 μL細(xì)胞懸液用熒光顯微鏡檢測酵母細(xì)胞的活性。

1.8 酵母細(xì)胞核的DAPI染色法

不同處理組分別取1 mL過夜培養(yǎng)的酵母菌，經(jīng)離心沉淀后，用1 mL PBS緩沖液重復(fù)洗滌并收集酵母細(xì)胞。在4℃冰箱中，用1 mL 70%的乙醇固定2 h后，用1 mL PBS重復(fù)洗滌離心并去除上清液，在沉淀中加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（diamidine phenyl indole，DAPI）染色液（南京建成生物工程研究所，南京）振蕩搖勻，在室溫下避光10 min后用1 mL PBS緩沖液反復(fù)離心洗滌，取5 μL細(xì)胞懸液在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)。

1.9 酵母細(xì)胞凋亡檢測

取過夜培養(yǎng)的酵母細(xì)胞，加入Annexin V-FITC/PI（南京建成生物工程研究所，南京）進(jìn)行雙染，室溫避光孕育10 min后通過流式儀對凋亡的細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.10 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。組間的差異顯著性用字母表示，不同的小寫字母表示差異顯著（P<0.05），不同的大寫字母表示差異極其顯著（P<0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Vc、RE 清除 DPPH 的半抑制量（IC50）

由圖1、2結(jié)果可知：Vc在低質(zhì)量濃度下有很強的抗氧化性；在0.05～0.80 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，Vc的質(zhì)量濃度與清除率線性相關(guān)，可以用Vc對DPPH的清除率來表示抗氧化能力，Vc的50%抑制質(zhì)量濃度（50%inhibitive concentration，IC50）為 0.10 g/L；高質(zhì)量濃度的RE也有很強的抗氧化性，在RE質(zhì)量濃度為0.50～3.00 g/L范圍內(nèi)具有線性相關(guān)，可以用DPPH的清除率表示RE對自由基的清除能力，RE的 IC50為 1.50 g/L。

2.2 砷對酵母細(xì)胞生長的影響

酵母細(xì)胞生長曲線的測定比較了不同濃度As對酵母細(xì)胞的脅迫作用，通過比較選擇脅迫作用明顯但并沒有完全抑制酵母細(xì)胞生長的濃度作為砷的脅迫濃度。由圖3的生長曲線可知：釀酒酵母在正常培養(yǎng)情況下，8～18 h之間進(jìn)入快速生長的對數(shù)期，16 h后進(jìn)入緩慢生長的穩(wěn)定期；在酵母細(xì)胞培養(yǎng)液中加入As后，隨著添加濃度加大，酵母細(xì)胞生長受到抑制，當(dāng)As濃度為2.0 mmol/L時，酵母生長停滯，當(dāng)As濃度為1.0 mmol/L時，與正常組和低濃度組相比，酵母雖沒有被完全抑制，但生長極其緩慢。故試驗選取1.0 mmol/L作為砷脅迫酵母細(xì)胞的添加濃度。

圖1 Vc的DPPH清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 DPPH clearance standard curve of Vc

圖2 RE的DPPH清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 DPPH clearance standard curve of RE

圖3 不同濃度砷脅迫下酵母細(xì)胞的生長曲線Fig.3 Growth curve of yeast cell under As stress in different concentrations

2.3 RE對砷脅迫下酵母細(xì)胞抑制率和生長率的影響

As的濃度為1.0 mmol/L時，其對酵母細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，試驗通過添加Vc和RE比較了不同添加物對砷脅迫下酵母細(xì)胞生長率和抑制率的影響。結(jié)果如圖4顯示：在酵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加RE對酵母細(xì)胞的正常生長無影響，培養(yǎng)24 h后，C組和RE組的生長抑制率最低，兩組之間差異不顯著（P>0.05）；在酵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加Vc，酵母細(xì)胞生長抑制率雖然低，但Vc組生長抑制率顯著高于C組和RE組（P<0.05）；在酵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加As，As組生長抑制率最高達(dá)68%，極顯著高于其他組別（P<0.01）；酵母細(xì)胞在砷脅迫的情況下添加RE后，盡管生長抑制率極顯著高于C組、RE組和Vc組（P<0.01），但生長抑制率明顯降低，As+RE組抑制率顯著低于As+Vc組（P<0.05）。

圖4 不同培養(yǎng)組酵母細(xì)胞抑制率的比較Fig.4 Comparison of inhibition rate of yeast cell in different culture groups

圖5中MTT檢測酵母生長率結(jié)果顯示：C組、RE組和Vc組酵母細(xì)胞的生長率高，RE的添加對酵母細(xì)胞生長無影響，RE組和C組組間差異不顯著（P>0.05），但RE組酵母的生長率顯著高于Vc組（P<0.05）；培養(yǎng)液中添加As后，嚴(yán)重抑制了酵母細(xì)胞的生長，As組生長率最低，極顯著低于其他組別（P<0.01），當(dāng)砷脅迫酵母培養(yǎng)液中添加RE后，As+RE組生長率顯著高于As+Vc組（P<0.05）。

2.4 RE對砷脅迫下酵母細(xì)胞存活率的影響

圖5 不同培養(yǎng)組酵母細(xì)胞生長率的比較Fig.5 Comparison of yeast cell growth rate in different culture groups

平板點樣法是檢測酵母細(xì)胞存活率的經(jīng)典方法，試驗通過10倍梯度稀釋平板點樣法比較了Vc和RE的添加對砷脅迫酵母細(xì)胞存活率的影響。由圖6、7可知：無論培養(yǎng)24 h還是48 h，在沒有砷脅迫的情況下，在培養(yǎng)液中添加RE，酵母細(xì)胞的生長和存活率均明顯高于Vc組，與C組差異不顯著，培養(yǎng)48 h后，RE組和C組均可在104稀釋倍數(shù)下觀察到清晰的菌落生長，但Vc組在104稀釋倍數(shù)下觀察不到菌落生長；在砷脅迫下，酵母細(xì)胞生長受到抑制，As組僅在101稀釋倍數(shù)下可以看到生長的菌落，當(dāng)培養(yǎng)液中添加RE后，As+RE組細(xì)胞的存活率明顯高于As+Vc組別，As+RE組可在103稀釋倍數(shù)下看到清晰的菌落生長，但As+Vc組僅能在102稀釋倍數(shù)下觀察到生長的菌落。

圖6 不同培養(yǎng)組24 h酵母細(xì)胞存活率的比較Fig.6 Cpmparison of survival rate of yeast cell cultured for 24 h in different culture groups

2.5 RE對砷脅迫下酵母細(xì)胞FDA/PI雙染的影響

圖7 不同培養(yǎng)組48 h酵母細(xì)胞存活率的比較Fig.7 Cpmparison of survival rate of yeast cell cultured for 48 h in different culture groups

As濃度為1 mmol/L時，其對酵母細(xì)胞的生長有明顯的抑制效應(yīng)，但無法判斷酵母細(xì)胞的存活狀態(tài)。FDA/PI雙染則可以通過顯微鏡觀察區(qū)分死亡細(xì)胞和存活細(xì)胞，從而進(jìn)一步比較Vc和RE的添加對砷脅迫酵母細(xì)胞存活狀態(tài)的影響。從圖8、9可知：添加RE對酵母的正常生長沒有影響，RE組與C組中FDA染色的存活綠色熒光細(xì)胞多，PI染色的死亡紅色熒光細(xì)胞少，兩組之間酵母細(xì)胞死亡率低且差異不顯著（P>0.05）；在Vc組中可以明顯觀察到死亡的紅色熒光細(xì)胞，其細(xì)胞死亡率顯著高于RE組和C組；在培養(yǎng)液中添加As后，在相同的觀察視野中酵母細(xì)胞數(shù)很少，說明砷不但明顯抑制酵母細(xì)胞的生長，而且死亡細(xì)胞極顯著高于其他組別（P<0.01）；RE和Vc的添加緩解了砷脅迫下酵母細(xì)胞生長的抑制和死亡，但相較于RE+As組，Vc+As組的酵母細(xì)胞死亡更明顯（P<0.05）。

圖8 不同培養(yǎng)組酵母細(xì)胞FDA/PI染色的比較Fig.8 Comparison of FDA/PI staining of yeast cell in different culture groups

2.6 RE對砷脅迫酵母細(xì)胞核DAPI染色的影響

圖9 不同培養(yǎng)組酵母細(xì)胞FDA/PI染色相對死亡率的比較Fig.9 Comparison of yeast cell relative mortality by FDA/PI staining in different culture groups

DAPI為細(xì)胞核染液，可以在顯微鏡下觀察并比較Vc和RE的添加對砷脅迫酵母細(xì)胞核凋亡的影響。圖10結(jié)果顯示：C組、RE組和Vc組經(jīng)DAPI染色的酵母細(xì)胞核呈現(xiàn)規(guī)則的圓形，且正常均勻分布在細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象不明顯；而As+RE組、As+Vc組和As組中細(xì)胞核有固縮且聚集在細(xì)胞一側(cè)的現(xiàn)象，尤其在As組中，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯，細(xì)胞核固縮且核內(nèi)染色質(zhì)發(fā)生降解，同時可以觀察到凋亡細(xì)胞體積變大。在培養(yǎng)液中添加RE和Vc后緩解了酵母細(xì)胞的凋亡，且添加RE后的緩解作用優(yōu)于Vc。

圖10 不同培養(yǎng)組酵母細(xì)胞DAPI染色的比較Fig.10 Comparison of DAPI staining of yeast cell in diffierent culture groups

2.7 RE對砷脅迫下酵母細(xì)胞凋亡的影響

酵母細(xì)胞凋亡除采用DAPI細(xì)胞核染色形態(tài)學(xué)觀察外，也可以通過Annexin V-FITC/PI雙染的流式細(xì)胞凋亡檢測，比較Vc和RE的添加在不同細(xì)胞周期對砷脅迫酵母細(xì)胞凋亡的影響。其結(jié)果如圖11、12顯示，通過圖中四個象限中細(xì)胞數(shù)的變化可知：C組和RE組間細(xì)胞凋亡率無顯著差異（P>0.05），兩組圖中增殖的酵母細(xì)胞主要存在于左下象限中，僅有少數(shù)早期凋亡細(xì)胞存在于右下象限中，且凋亡率低；Vc組細(xì)胞凋亡率顯著高于RE組和C組（P<0.05），圖11中除左下象限中增殖的酵母細(xì)胞外，右下象限中早期凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多；砷脅迫下，As組酵母細(xì)胞的凋亡極顯著提高（P<0.01），細(xì)胞相對凋亡率中包括了右下象限的早期凋亡細(xì)胞、右上象限的晚期凋亡細(xì)胞和左上象限中的死亡細(xì)胞；添加RE和Vc后，酵母細(xì)胞相對凋亡率極顯著下降（P<0.01），RE+As組中早晚期凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，RE組的細(xì)胞凋亡率顯著低于Vc+As組（P<0.05）。Annexin V-FITC/PI雙染流式檢測酵母細(xì)胞凋亡結(jié)果與DAPI細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果一致。

圖11 不同培養(yǎng)組酵母細(xì)胞凋亡的比較Fig.11 Comparison of cell yeast apoptosis in different culture groups

圖12 不同培養(yǎng)組酵母細(xì)胞凋亡率的比較Fig.12 Comparison of yeast cell apoptosis rate in different culture groups

3 討論

流行病學(xué)研究顯示，環(huán)境飲水型砷中毒破環(huán)了機體的抗氧化防御系統(tǒng)，增加了肺癌、皮膚癌等各種癌癥的風(fēng)險[21-23]，同時還與心腦血管疾病、生殖毒性等疾病緊密相關(guān)[24-25]。本試驗以釀酒酵母為對象，因其具有像細(xì)菌一樣的簡易操作性，已發(fā)展成為研究人類凋亡、疾病以及衰老等的優(yōu)勢工具菌種[26-29]。為確定砷脅迫酵母的濃度，試驗將不同濃度的As添加在培養(yǎng)液中判斷其對酵母細(xì)胞生長的影響。當(dāng)濃度為1.0 mmol/L時，酵母生長極其緩慢，但沒有停滯，通過對酵母的生長率、抑制率、存活率和凋亡率等進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，1.0 mmol/L As的添加極顯著降低了酵母的生長率與存活率，且極顯著提高了酵母細(xì)胞的凋亡率，可確定該濃度為砷脅迫酵母細(xì)胞的添加量。

近年來，天然植物及植物提取物因功能強、無毒、環(huán)保等諸多優(yōu)點[30]而成為研究熱點。白藜蘆醇[31]和甘草多糖[32]等多種抗氧化物質(zhì)被證明具有提高機體抗氧化力、緩解氧化損傷的功能。Vivancos等[33]報道，植物甾醇可以通過增加抗氧化酶活性提高抗氧化作用。玫瑰花富含黃酮、多酚等各類物質(zhì)，對腫瘤疾病有一定的治療作用[34]。在該試驗中，我們選取DPPH清除率同為50%的Vc（0.10 g/L）和RE（1.50 g/L）作為細(xì)胞凋亡抑制劑，以Vc為參照，利用RE的添加來改善砷對酵母細(xì)胞的脅迫作用。從試驗結(jié)果可知，酵母細(xì)胞的生長率和存活率極顯著提高，抑制率和凋亡率極顯著下降，說明RE作為天然植物提取物有非常好的抗氧化作用。同時試驗結(jié)果還顯示，無論是在非脅迫狀態(tài)下RE組和Vc組之間比較，還是在砷脅迫狀態(tài)下As+RE組和As+Vc組之間比較，添加RE的組別酵母細(xì)胞生長率和存活率都顯著高于添加Vc的組別，酵母細(xì)胞的生長抑制率、死亡率和凋亡率都顯著低于添加Vc的組別。已有研究證實，綠茶提取物表現(xiàn)出多重作用機制，對正常細(xì)胞無害，但能加速癌細(xì)胞凋亡，對癌變細(xì)胞起到積極的治療作用[35-36]。RE的作用機制同樣具有多重效應(yīng)，其添加對正常酵母細(xì)胞無害，但對砷脅迫下的酵母細(xì)胞起到了積極的損傷修復(fù)作用。我們推測其原因為Vc是單一成分抗氧化劑，在體外具有很強的清除自由基清除反應(yīng)的能力，因此其對DPPH的清除率效果明顯高于RE。但當(dāng)Vc作用于體內(nèi)時，因受到復(fù)雜的基因調(diào)控的影響，故對使用劑量有嚴(yán)格的控制，而50%DPPH清除率的Vc添加量可能已超出其體內(nèi)使用的安全閾值，因此，試驗中無論作用于正常酵母細(xì)胞或砷脅迫下的酵母細(xì)胞，Vc的作用效果都低于RE。RE是混合天然提取物，提取物中含有十多種甚至上百種的天然成分，其功能可能具有多重效應(yīng)，但是具體的作用機制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，RE是一種非常好的抗氧化劑，在1.5 mmol/L的添加濃度下，對正常酵母細(xì)胞的生長沒有任何影響，對砷脅迫的酵母細(xì)胞可以提高其生長率和存活率，降低細(xì)胞的生長抑制率、死亡率和凋亡率。該試驗同時證實了RE作為天然植物提取物，其綠色、無毒的作用機制將在對抗重金屬污染、提高機體抗氧化力、緩解氧化損傷等方面有著更廣闊的應(yīng)用前景。