金建華,李永元,才項(xiàng)措

(青海民族大學(xué) 青藏高原資源化學(xué)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810007)

0 引言

唐古特青蘭(Dracocephalumtanguticum)，又名甘青青蘭，為唇形科青蘭屬植物[1]，藏語(yǔ)名priyangku( 知羊格)，產(chǎn)于中國(guó)西藏、青海、四川和甘肅等地，生于海拔1 900～4 000 m的陽(yáng)坡、干燥河谷、草灘、高山或松林林緣，是青藏高原特有植物，在藏藥中用途甚廣。藏醫(yī)藥典籍《晶珠本草》中記載：知羊格味甘、苦、清膽熱、止血、愈瘡、燥黃水，全草用于治療黃疸型肝炎、胃炎、胃潰瘍、氣管炎、頭暈、神疲、關(guān)節(jié)炎及癤瘡等病癥，具有清熱利濕、止血、化瘓止咳等功效[2-3]。唐古特青蘭在改善缺氧造成的心、腦等組織的病理學(xué)損傷、降血糖、保肝、抗菌、抗病毒等方面有許多獨(dú)到之處[4-5]。唐古特青蘭主含黃酮甙、多糖、 揮發(fā)油、 氨基酸、 甾類、 齊墩果酸、熊果酸、 胡蘿卜甙等化學(xué)成分，其中多糖是一類重要的生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)人體免疫力、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗缺氧、抗菌、抗病毒、保護(hù)肝臟等作用，且不會(huì)對(duì)生命體產(chǎn)生直接的毒害作用[6-7]。目前，提取各種植物多糖的方法較多[8-9]，主要為熱水浸提取法和超聲波輔助浸提取法。熱水浸提取法工藝簡(jiǎn)單，提取的主要是胞外多糖，多糖提取率較低；超聲波浸提取法多糖提取率較高，但長(zhǎng)時(shí)間超聲，對(duì)多糖分子結(jié)構(gòu)有一定破壞作用?？焖偃軇┹腿?超聲波輔助提取法是多糖提取的創(chuàng)新性工作，該方法具有浸提取時(shí)間短、對(duì)生物活性影響小、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，并在藏藥活性成分提取研究方面初步得到了應(yīng)用[10-11]。鑒于快速溶劑萃取-超聲波提取唐古特青蘭多糖的研究較為少見，本研究依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以多糖提取率作為響應(yīng)值，選取多糖提取時(shí)間、提取溫度、液料比等3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析法中Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12-14]，對(duì)唐古特青蘭多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為藏藥活性成分提取的研究提供新的思路。

1 研究方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：唐古特青蘭藥材采于青海省海西州都蘭縣，經(jīng)青海某藏藥業(yè)股份有限公司主管藥師鑒定為唇形科青蘭屬植物唐古特青蘭的帶根全草，藥材標(biāo)本(編號(hào)TQT2018714)存放于青藏高原資源化學(xué)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)實(shí)驗(yàn)室。將唐古特青蘭樣品清洗干凈、陰干、粉碎過(guò)60目篩備用。

試劑：苯酚，D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，濃硫酸，乙醇(95%)，氯仿、甲醇、正丁醇、中性蛋白酶、α-淀粉酶等均為分析純。

儀器：FW-177中草藥粉碎機(jī)；Beckman 高速離心機(jī)；RE-5002型減壓濃縮蒸發(fā)儀；ASE-350型快速溶劑萃取儀；40-KHZ型超聲波發(fā)生器；UV-2450 型紫外-可見分光光度計(jì)；AL204 電子天平。

1.2 試劑的配制

1.2.1 5%苯酚液的配制

稱取5.0 g苯酚，加適量的蒸餾水使苯酚溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，搖勻即可。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取250 mg的葡萄糖于燒杯中，加入適量的蒸餾水，溶解后轉(zhuǎn)移至250 mL棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為l mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 最大吸收波長(zhǎng)選擇

精確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，加入新配制的1.0 mL 5%苯酚溶液，混和均勻后，滴加濃硫酸6.0 mL，搖勻，水浴加熱20 min后，冷卻20 min，用蒸餾水定容至20 mL，備用。取溶液適量，在400～700 nm 范圍內(nèi)掃描，確定多糖類成分的最大吸收波長(zhǎng)，另取蒸餾水同法平行操作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)表明，在490 nm處有最大吸收峰，說(shuō)明在490 nm波長(zhǎng)處，供試品溶液中其他成分對(duì)多糖的顯色與吸收干擾最小，故選定490 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

分別移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL于10 mL的容量瓶中，分別依次加入1.0 mL的蒸餾水，5%苯酚溶液2.0 mL，搖勻，迅速分別滴加濃硫酸6.0 mL，完成以上操作后放在90 ℃的水浴中加熱30 min，冷卻至室溫，加蒸餾水定容，搖勻，靜置15 min。用1 cm石英比色皿于490 mm處分別測(cè)定吸光度，另取蒸餾水同法平行操作空白對(duì)照，以吸光度A和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度C(mg/mL)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=18.675C+0.001 2，相關(guān)系數(shù)r=0.998 1。說(shuō)明溶液在0～0.100 0mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

1.3.3 多糖的提取工藝流程

準(zhǔn)確稱取10 g唐古特青蘭粉末，室溫下，設(shè)定壓力為300 psi，以水為萃取溶劑，用快速溶劑萃取儀萃取10 min后，在200 W下按照先萃取后超聲的操作順序，聯(lián)合提取唐古特青蘭多糖，抽濾除去殘?jiān)?，以濾液與乙醇的體積比為1∶4加無(wú)水乙醇醇沉過(guò)夜，離心，取沉淀利用Sevage法除去蛋白，無(wú)水乙醇洗滌，真空干燥，得到多糖粉末。

1.3.4 多糖的測(cè)定

按1.3.3項(xiàng)進(jìn)行多糖提取，在490 nm吸收波長(zhǎng)下，按1.3.2項(xiàng)所述方法，測(cè)定溶液的吸收度(A)，計(jì)算多糖含量。

1.3.5 多糖提取單因素試驗(yàn)

以純水為提取劑，考查液料比、提取溫度、提取時(shí)間等因素對(duì)唐古特青蘭中多糖提取率的影響。

1.3.6 唐古特青蘭多糖提取的響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用響應(yīng)面法Box-benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取時(shí)間、提取溫度、液料比為因素，以多糖提取率為響應(yīng)值，優(yōu)化唐古特青蘭中多糖的提取工藝，因素水平見表1。

表1 Box-behnken因素水平Tab.1 Box-behnken factor levels

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比

在溫度為50 ℃、提取時(shí)間為80 min、超聲波功率為200 W下，考察液料比對(duì)多糖提取率影響，見圖2。

圖2 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of Liquid- solid ratio on extraction rate of polysaccharide

由圖2可見，隨著液料比的增加，多糖提取率也隨著增大，當(dāng)液料比為7 mL/mg時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高值，隨后趨于平緩，表明多糖在溶液中溶解已達(dá)到飽和，綜合考慮，在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，以液料比7 mL/mg作為中心值。

2.1.2 提取溫度

在液料比為7 mL/mg、提取時(shí)間80 min、超聲波功率200 W條件下，考察溫度對(duì)多糖提取的影響，見圖3。

圖3 溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide

2.1.3 提取時(shí)間

以50 ℃為多糖提取溫度、液料比為7 mL/mg、超聲波功率為200 W的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響，見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide

由圖4可知，多糖提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，80 min后，時(shí)間對(duì)多糖提取率影響不顯著，多糖在溶液中溶解達(dá)到飽和，因此，從節(jié)省能耗和操作時(shí)間考慮，在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，選定80 min為提取時(shí)間的中心值。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以多糖提取率作為響應(yīng)值，選取多糖提取時(shí)間、提取溫度、液料比等3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析法中Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2和表3。

表2 Box-behnKen試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Box-behnken experimental design and results

2.2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化方程的建立及方差分析

夏國(guó)忠默默地放下電話，傳令下去，把重傷員送往后方醫(yī)院，輕傷就地包扎治療?，F(xiàn)在，那怕是多一個(gè)人在，就多一分勝利的希望。

通過(guò)Design-expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，擬合得到提取溫度、提取時(shí)間、液料比3個(gè)影響因素與多糖提取率(Y)的二次多項(xiàng)式回歸方程：

Y=65.50+4.78A+0.47B+2.98C-1.12AB-0.83AC+2.22BC-9.64A2-3.74B2-3.59C2

該回歸多項(xiàng)式方程的總決定系數(shù)R2=0.983 7，表明該二次多項(xiàng)式回歸方程可信度高，方程能較好地預(yù)測(cè)和分析多糖的提取率。

表3 二次多項(xiàng)式模型方差分析Tab.3 Analysis of variance of quadratic polynomial model

由表3可知，通過(guò)方差分析，該二次多項(xiàng)式回歸方程模型F值為28.77，P<0.000 1，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)顯著性。失擬項(xiàng)P=0.108 2>0.05，不顯著，表明該模型可信度高，能較好地預(yù)測(cè)和分析多糖的提取率。

表4 二次多項(xiàng)式模型顯著性分析Tab.4 Significance analysis of quadratic polynomial model

由表4可知，提取溫度(A)、液料比(C)的P值均小于0.01，提取時(shí)間(B)的P值大于0.05，說(shuō)明液料比和提取溫度對(duì)多糖的提取率影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提取時(shí)間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)另外，交互項(xiàng)(AB、AC、BC)及二次項(xiàng)(A2、B2、C2)P<0.05，對(duì)多糖提取率的影響顯著，3個(gè)因素影響順序?yàn)椋禾崛囟?液料比>提取時(shí)間。

表5 模型的可信度分析Tab.5 Reliability analysis of the model

表6 模型置信度分析Tab.6 Model confidence analysis

由表5和表6可知，二次多項(xiàng)式模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)效果好，可較好地預(yù)測(cè)和分析多糖的提取率。

由圖5也可以看出，多糖提取率實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值存在良好的線性關(guān)系，回歸方程能較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)唐古特青蘭多糖的提取率。

圖5 多糖提取率實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值關(guān)系圖Fig.5 Comparison of experimental and predicted extraction rates of polysaccharides

2.2.3 因素交互作用分析

提取溫度、液料比、提取時(shí)間3個(gè)因素存在顯著的交互作用，結(jié)果見圖7(a～b)。從圖7(a～b)可知，3個(gè)因素兩兩之間交互作用的響應(yīng)曲面坡度較陡峭，等高線密集，交互作用強(qiáng)。這與方差分析結(jié)果相符。

圖6 兩因素交互作用對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface and contour map of interaction of two factors on polysaccharide extraction rate

2.2.4 優(yōu)化工藝參數(shù)的預(yù)測(cè)

采用響應(yīng)面法，可得唐古特青蘭中多糖最優(yōu)提取工藝條件為：在溶劑萃取儀壓力為300 psi、超聲波功率為200 W下，液料比為7.71 mL/mg，提取溫度為51.59 ℃，提取時(shí)間為80 min，該條件下多糖的理論預(yù)測(cè)提取率為67.36%。考慮實(shí)驗(yàn)室操作的可行性，修正提取工藝條件為：液料比為8 mL/mg，提取溫度為52 ℃，提取時(shí)間為80 min。

2.2.5 優(yōu)化工藝參數(shù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了考察優(yōu)化工藝的穩(wěn)定性、可行性，在該工藝條件下，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)3次，多糖的提取率結(jié)果見表7。由表7可知，多糖提取率的平均值為67.28%，與理論預(yù)測(cè)值67.36%的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.059 5%，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可行。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of verification tests

3 結(jié)語(yǔ)

1)植物多糖是一類重要的生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)人體免疫力、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗缺氧、抗菌、抗病毒、保護(hù)肝臟等作用?；诂F(xiàn)有的唐古特青蘭多糖的提取方法具有一定的局限性，本研究采用的快速溶劑萃取-超聲波輔助提取法，既能加速提取液滲透過(guò)程，有效破壞細(xì)胞壁，加快多糖溶解，提高多糖的提取率，同時(shí)還能降低提取溶劑水的用量，縮短提取時(shí)間，降低多糖提取成本。

2)采用響應(yīng)面法對(duì)藏藥唐古特青蘭多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，多糖最佳提取工藝條件為：在溶劑萃取儀壓力為300 psi、超聲波功率為200 W下，提取溫度52 ℃、提取時(shí)間80 min、液料比為8 mL/mg。在此工藝條件下，多糖提取率的實(shí)際測(cè)量平均值為67.28%，與理論預(yù)測(cè)值67.36%基本吻合。

3)本研究是以水為溶劑，在快速溶劑萃取-超聲波輔助下，進(jìn)行唐古特青蘭中多糖的提取。由于多糖是一類重要的生物活性物質(zhì)，因此，該研究可為藏藥資源的開發(fā)和利用提供參考。