李玲玲

(重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物化學(xué)工程系，重慶 涪陵 408000)

0 引言

揮發(fā)油類(lèi)又稱(chēng)精油，是一類(lèi)具有揮發(fā)性可隨水蒸氣蒸餾出來(lái)的油狀液體，大部分具有香氣。青蒿精油含有豐富的單萜和倍半萜類(lèi)，是一種具有藥用價(jià)值的副產(chǎn)品[1]?，F(xiàn)代研究證明青蒿揮發(fā)油具有抗菌、抗癌、抗病毒、抗炎、驅(qū)蚊、殺蟲(chóng)、抗氧化等活性[2]。主要用途有治療痤瘡、抑制流感病毒、消炎、抗?jié)?、局部刺激和?qiáng)心、解熱、止咳、祛痰、平喘和鎮(zhèn)痛，并能作為保健食品[3]，還可用于研制驅(qū)蚊貼[4]。

揮發(fā)油的提取方法主要有4種：蒸餾法、溶劑提取法、壓榨法、二氧化碳超臨界流體提取法，其中蒸餾法又分為水蒸氣蒸餾法和直接蒸餾法[5]。影響青蒿揮發(fā)油提取含量的因素有提取方法、生長(zhǎng)采收期、貯存期、產(chǎn)地、部位等[6]。李春紅等[7]測(cè)定了5月至10月青蒿揮發(fā)油的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青蒿揮發(fā)油的含量隨生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)逐漸增高，9月份盛花期含量最高。青蒿不同部位揮發(fā)油收率花>葉>莖、根，甘肅慶陽(yáng)產(chǎn)青蒿莖和葉揮發(fā)油收率分別為2.8%和9.7%[6,8]。Yinta Li等[9]采用二氧化碳超臨界流體提取青蒿精油，原油收率達(dá)到了11.17%。

本研究以重慶涪陵地區(qū)9～10月青蒿植株的葉和花作為材料，采用水蒸氣蒸餾法提取其中的揮發(fā)油，測(cè)定揮發(fā)油的抑菌活性。為青蒿揮發(fā)油在抑菌領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：重慶市涪陵地區(qū)9～10月青蒿植株的葉和花。

抑菌試驗(yàn)指示菌：細(xì)菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC 10384、大腸埃希菌(Escherichiacoli)CICC 23657、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CICC 10275，均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。真菌：黑曲霉(Aspergillusniger)CICC 2487、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC 33032均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基。

試劑：無(wú)水乙醚(分析純、成都市科隆化學(xué)品有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

輕油揮發(fā)油測(cè)定器(安徽科騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、CL-2型恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、智能MHP-250型霉菌培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)、DNP-9272A型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海將任實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 材料的準(zhǔn)備

將采集的青蒿除去殘莖及無(wú)用部位，將留下的葉子和花蕾洗凈，濾干水分。

1.3.2 精油的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的青蒿葉和花，室溫下置蒸餾水中浸泡一段時(shí)間后，參照2015年版《中國(guó)藥典》(四部)揮發(fā)油測(cè)定法(甲法)提取青蒿精油[10]。

精油的得率按照下式計(jì)算：精油得率=揮發(fā)油體積/青蒿質(zhì)量×100%

(1)

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

考察浸泡時(shí)間、料液比、蒸餾時(shí)間3個(gè)因素對(duì)青蒿精油提取量的影響，每個(gè)因素取3個(gè)水平。

1.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以浸泡時(shí)間、料液比和蒸餾時(shí)間為自變量，以精油得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)了3因素3水平正交試驗(yàn)，探討精油最佳提取工藝。

1.6 抑菌試驗(yàn)

以5種代表性的指示菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母來(lái)檢測(cè)青蒿精油的抑菌活性，這5種指示菌中既有革蘭氏陽(yáng)性菌，也有革蘭氏陰性菌；既有細(xì)菌，也有真菌。

1.6.1 供試菌液的制備

利用牛肉膏蛋白胨斜面活化3 種供試細(xì)菌菌株，利用PDA培養(yǎng)基活化酵母和黑曲霉，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌于生理鹽水中(黑曲霉收集的是孢子)，制成含量約為1×107cfu/mL的供試菌液，備用[11]。

1.6.2 抑菌圈直徑的測(cè)定

采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定揮發(fā)油的抑菌效果。濾紙片浸透揮發(fā)油：揮發(fā)油與無(wú)水乙醚按1∶1體積比混勻。用打孔器將濾紙制作成直徑為6 mm的濾紙片，滅菌后烘干，浸泡于揮發(fā)油溶液中30 min，使之充分吸收，瀝干。

接種、涂布指示菌：用移液槍分別吸取100 μL制備好的供試菌液，加在相應(yīng)的平板上(3種指示細(xì)菌加在牛肉膏蛋白胨平板上，真菌加在PDA平板上)，用涂布棒涂布均勻。

貼濾紙片：用鑷子夾取3張濾紙片，呈“品”字形貼于相應(yīng)的加有指示菌的平板上。另外放1片只浸有乙醚的濾紙片作為空白對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次[12]。

培養(yǎng)：置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h，真菌在28 ℃下培養(yǎng)48～72 h)，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.6.3 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

采用倍比稀釋法測(cè)定揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母的MIC，進(jìn)一步檢測(cè)青蒿精油的抑菌程度。

液體培養(yǎng)基倍比稀釋揮發(fā)油：將滅菌后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(測(cè)細(xì)菌MIC)或馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基(測(cè)真菌MIC)分裝于7支試管中，第1管1.2 mL，其余各管1 mL。用移液槍吸取0.8 mL的青蒿精油于第1支試管內(nèi)，蓋上試管塞，混勻后吸出1 mL至第2支試管中，混勻再吸取1mL至第3支試管中，以此類(lèi)推，直至第7管，從第7管中吸出1 mL棄去。稀釋后，第1管至第7管中揮發(fā)油的體積分?jǐn)?shù)依次為：400 μL/mL、200 μL/mL、100 μL/mL、50 μL/mL、25 μL/mL、12.5 μL/mL、6.25 μL/mL。同時(shí)設(shè)置對(duì)照，對(duì)照一：在1 mL培養(yǎng)基中只加入30 μL青蒿精油；對(duì)照二：在含 1 mL培養(yǎng)基的試管中，只加入30 μL指示菌液。

接種指示菌液：在含不同體積分?jǐn)?shù)青蒿精油的試管(1～7號(hào)管)及對(duì)照二的試管中，分別加入1.6.1制備的供試菌液30 μL，充分混勻。(此時(shí)1～7號(hào)管中揮發(fā)油的體積分?jǐn)?shù)分別為：388.3 μL/mL、194.2 μL/mL、97.1 μL/mL、48.5 μL/mL、24.3 μL/mL、12.2 μL/mL、6.1 μL/mL)

培養(yǎng)：將上述各試管放入搖床振蕩培養(yǎng)，接種了3種指示細(xì)菌的試管在36 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)24 h；接種了釀酒酵母和黑曲霉的試管在28 ℃、150 r/min的條件下分別培養(yǎng)48 h和72 h。

檢查：取出試管，逐個(gè)檢查各試管的渾濁度。對(duì)照一完全透明、對(duì)照二渾濁，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果有效。其它各試管與對(duì)照一透明度一樣，表明指示菌的生長(zhǎng)被抑制；渾濁則說(shuō)明有指示菌生長(zhǎng)。取完全無(wú)指示菌生長(zhǎng)的最低揮發(fā)油濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿精油的性狀

青蒿精油為淡黃色的透明液體，有特異氣味，隨蒸餾時(shí)間延長(zhǎng)，黃色程度會(huì)逐漸加深。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)青蒿精油提取的影響

稱(chēng)取粉碎的青蒿葉30 g，置于500 mL圓底燒瓶中，固定蒸餾時(shí)間為4 h，浸泡時(shí)間為0 h，分別以料液比1∶7、1∶8、1∶9(質(zhì)量體積比)進(jìn)行精油的提取，研究料液比對(duì)青蒿葉和花中精油提取的影響，確定最佳料液比。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 料液比對(duì)青蒿精油提取的影響Tab.1 Effect of ratio of material to liquid on extraction of Artemisia annua essential oil

由表1可以看出，隨著料液比的增加，精油得率先增加，后減少。這可能是因?yàn)樗诌^(guò)少(料液比為1∶7)時(shí)不能充分浸潤(rùn)物料，導(dǎo)致提取不完全；水分過(guò)多時(shí)(料液比1∶9)，精油在水中的溶解度增加，導(dǎo)致提取的精油減少。因此最佳料液比為1∶8。

2.2.2 蒸餾時(shí)間對(duì)青蒿精油提取的影響

稱(chēng)取粉碎的青蒿葉30 g，置于500 mL圓底燒瓶中，固定浸泡時(shí)間為0 h，料液比為1∶8，分別蒸餾1 h、2 h、3 h進(jìn)行精油的提取，研究蒸餾時(shí)間對(duì)青蒿葉和花中精油提取的影響，確定最佳蒸餾時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 蒸餾時(shí)間對(duì)青蒿精油提取的影響Tab.2 Effect of distillation time on extraction of Artemisia annua essential oil

由表2可以看出，1～2 h隨著蒸餾時(shí)間的增加，精油得率逐漸增加；2～3 h隨著蒸餾時(shí)間的增加，精油得率降低。這可能是由于2 h時(shí)精油已經(jīng)提取完全，繼續(xù)延長(zhǎng)蒸餾時(shí)間，由于精油的易揮發(fā)性，導(dǎo)致提取出的精油揮發(fā)損失了一部分，從而導(dǎo)致精油的得率下降。另外隨著蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)，青蒿精油的顏色由淡黃色逐漸變深。因此最佳的蒸餾時(shí)間為2 h。

2.2.3 浸泡時(shí)間對(duì)青蒿精油提取的影響

稱(chēng)取粉碎的青蒿葉30 g，置于500 mL圓底燒瓶中，固定蒸餾時(shí)間為4 h，料液比1∶8，分別以浸泡時(shí)間為0 h、1.5 h、3 h進(jìn)行精油的提取，研究浸泡時(shí)間對(duì)青蒿葉和花中精油提取的影響，確定最佳浸泡時(shí)間。結(jié)果表3。

表3 浸泡時(shí)間對(duì)青蒿精油提取的影響Tab.3 Effect of soaking time on extraction of Artemisia annua essential oil

由表3可以看出，0～1.5 h隨著浸泡時(shí)間的增加，青蒿精油的得率逐漸增加，1.5～3 h，隨著浸泡時(shí)間的增加，精油得率不再變化。因此最佳浸泡時(shí)間為1.5 h。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，每一單因素分別選取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。分別取青蒿葉和花30 g，按照表5中的1～9號(hào)處理進(jìn)行青蒿精油的提取，以得率為指標(biāo)，進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見(jiàn)表5。用SPSS Statistics 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.4 Level table of factors for orthogonal test

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Orthogonal test results

表6 提取工藝對(duì)青蒿精油得率影響的方差分析Tab.6 Variance analysis of influence of extraction process on the yield of Artemisia annua essential oil

由表6可以看出，影響青蒿精油得率的主次順序?yàn)锳>B>C，即浸泡時(shí)間>蒸餾時(shí)間>料液比。青蒿精油的最佳提取工藝條件為A2B3C2，即浸泡時(shí)間1.5 h，蒸餾時(shí)間為3 h，料液比為1∶8。由表6可以看出，各因素的水平變化對(duì)青蒿精油得率均無(wú)顯著影響。

2.4 青蒿精油對(duì)指示菌的抑菌效果

通過(guò)濾紙片法測(cè)定青蒿精油(體積濃度為500 μL/mL)對(duì)5種指示菌的抑菌效果，結(jié)果表明青蒿精油對(duì)5種指示菌均有一定的抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)圖1和表7。

表7 青蒿精油對(duì)5種指示菌的抑菌圈大小Tab.7 Antimicrobial circle size of Artemisia annua essential oil to five indicators

注：a)金黃色葡萄球菌；b)大腸埃希菌；c)枯草芽孢桿菌；d)黑曲霉；e)釀酒酵母。圖1 青蒿精油對(duì)5種指示菌的抑菌效果Fig.1 Antimicrobial effect of Artemisia annua essential oil on five indicatorsNote:a)Staphylococcus aureus;b)Escherichia coli;c)Bacillus subtilis;d)Aspergillus niger;e)Saccharomyces cerevisiae

采用液體稀釋法測(cè)定青蒿精油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母的MIC，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 青蒿精油對(duì)5種指示菌的MIC測(cè)定結(jié)果Tab.8 MIC determination of Artemisia annua essential oil for five indicators

從表8中可以看出，青蒿精油對(duì)細(xì)菌中的金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，MIC為48.5 μL/mL。對(duì)真菌中的釀酒酵母抑菌效果最好，MIC為48.5 μL/mL。

3 討論與結(jié)論

考慮環(huán)境污染及生產(chǎn)實(shí)際等多方面因素對(duì)試驗(yàn)造成的影響，本研究選擇水作為提取溶劑。選擇揮發(fā)油測(cè)定器作為收集器，由于水的密度大于青蒿的精油的密度，提取中水相位于餾出液的下層。在測(cè)定最低抑菌濃度時(shí)，比較了濾紙片法和液體培養(yǎng)基倍比稀釋揮發(fā)油法的測(cè)定效果，發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)基倍比稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度的效果更好，通過(guò)液體培養(yǎng)基是否渾濁更容易判斷揮發(fā)油的抑菌程度。

本研究得到了青蒿葉和花蕾中精油提取的最佳工藝：浸泡時(shí)間為1.5 h，蒸餾時(shí)間為3 h，料液比為1∶8。提取出的青蒿精油對(duì)5種指示菌(金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母)均有一定的抑菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌和釀酒酵母的抑菌效果最好，MIC均為48.5 μL/mL。