吳麗華,儀慧蘭,陳燕飛,喬宏萍,趙文婧

(1.太原師范學(xué)院 生物系,山西 晉中 030619;2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

0 引言

細(xì)胞凋亡是一種由基因嚴(yán)格控制的程序性細(xì)胞死亡方式,在調(diào)控機(jī)體生長發(fā)育和對外界刺激的反應(yīng)等生物學(xué)過程中起重要作用。已有研究表明,細(xì)胞凋亡的異?？稍黾佣喾N疾病的發(fā)病率,如神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng),甚至癌癥等[1]。因此,細(xì)胞凋亡成為近年來整個生命科學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的研究熱點。

砷是一種廣泛分布于自然界中的有毒元素,可以通過皮膚、消化道、呼吸道等多種途徑進(jìn)入人體,并可對人體健康造成嚴(yán)重威脅[2]。大量研究顯示,長期或急性接觸砷可破壞機(jī)體原有的氧化/還原平衡,誘導(dǎo)生物體內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的產(chǎn)生[3-5]。當(dāng)體內(nèi)大量ROS無法被及時清除時,即可引起細(xì)胞死亡或凋亡[6-8]。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶之一。在模式生物酵母細(xì)胞中,SOD主要包括分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體膜間隙的CnZnSOD(SOD1)和分布于線粒體基質(zhì)內(nèi)的MnSOD(SOD2)[9]。我們的前期研究表明,高濃度砷可改變酵母細(xì)胞SOD及其他抗氧化酶活性,引起細(xì)胞氧化損傷,誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或凋亡[10-11],但SOD1和SOD2基因在砷誘導(dǎo)酵母細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制尚不清楚。因此,本實驗選用酵母野生株BY4741和其突變體Δsod1,Δsod2為研究材料,研究SOD1和SOD2基因缺失對亞砷酸鈉誘導(dǎo)酵母細(xì)胞凋亡的影響,以期為砷的毒性機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株

釀酒酵母BY4741(MATahis3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0,WT)及其突變體Δsod1和Δsod2,均購自Invitrogen公司。

1.2 材料培養(yǎng)

挑取酵母細(xì)胞單菌落接種于YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)液體培養(yǎng)基中(1%酵母粉,2%蛋白胨,2%葡萄糖，純度為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)),28℃,180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后用于毒性處理。固體培養(yǎng)基中需加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1.5%～2%的瓊脂粉。

1.3 細(xì)胞生長測定

取適量對數(shù)期細(xì)胞接種于含有不同濃度亞砷酸鈉(0～2 mmol/L)的液體培養(yǎng)基中(每個樣本初始OD600一致),28℃,180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng),每隔2 h取適量培養(yǎng)液測其OD600,繪制生長曲線;以野生株酵母(WT)培養(yǎng)24 h后的OD600為對照,計算相對生長率(OD600處理組/OD600野生株對照組×100%)。收集所有菌株培養(yǎng)24 h后，對照組和1 mmol/L處理組細(xì)胞,檢測胞內(nèi)ROS水平、線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡率。

1.4 細(xì)胞存活率測定

參照Zheng等方法[12],將適量對數(shù)期細(xì)胞涂布至含有不同濃度亞砷酸鈉的平板上,每個平板含有細(xì)胞數(shù)約200個,28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h后觀察計數(shù)單菌落數(shù),并計算細(xì)胞相對存活率(處理組單菌落數(shù)/對照組單菌落數(shù)×100%)。每個處理組至少3個重復(fù)。

1.5 細(xì)胞凋亡率、胞內(nèi)ROS和線粒體膜電位測定

將用PBS洗滌后的酵母細(xì)胞用適量Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液重懸后加入Annexin Ⅴ-FITC和Propidium Iodide(碘化丙啶,PI)染液;或分別懸浮于一定濃度的2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA,ROS熒光探針)和Rhodamine 123(Rho123,羅丹明123)中,混勻,避光孵育20 min,用流式細(xì)胞儀檢測酵母細(xì)胞凋亡率、胞內(nèi)ROS水平和線粒體膜電位。其中,每個樣品由3個平行樣品混合,檢測不少于50 000個細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0對所得結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析,野生酵母中處理組與對照組間的差異顯著性用“*”表示(*P<0.05,**P<0.01);相同砷濃度處理組中,突變株與野生株間的差異顯著性用“&”表示(&P<0.05,&&P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 SOD1、SOD2基因缺失對亞砷酸鈉抑制酵母細(xì)胞生長的影響

從圖1A可以看出,野生株酵母在亞砷酸鈉脅迫下,生長受到抑制。隨著亞砷酸鈉濃度的升高,培養(yǎng)液OD600逐漸降低；當(dāng)亞砷酸鈉濃度為2 mmol/L時,酵母細(xì)胞幾乎完全停止生長,抑制率高達(dá)92.86%。在1 mmol/L和1.5 mmol/L處理組中,培養(yǎng)24 h后,Δsod1相對生長率顯著低于野生酵母,而Δsod2相對生長率與野生酵母無顯著差異(圖1B)。結(jié)果說明,亞砷酸鈉可抑制酵母細(xì)胞生長,SOD1基因在細(xì)胞生長過程中起重要作用。

2.2 SOD1、SOD2基因缺失對亞砷酸鈉誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡的影響

由圖2可知,野生酵母細(xì)胞經(jīng)亞砷酸鈉脅迫后,細(xì)胞相對存活率隨砷濃度的升高而逐漸降低。在1～2 mmol/L處理組中,細(xì)胞相對存活率顯著低于對照組。1 mmol/L和1.5 mmol/L處理組中,Δsod1相對存活率顯著低于野生酵母,分別為野生株的21.52%和2.09%;Δsod2與野生酵母間無顯著差異(P>0.05)。根據(jù)細(xì)胞相對生長率和存活率結(jié)果,我們在后續(xù)實驗中選取1 mmol/L作為亞砷酸鈉處理濃度。

A, 野生株; B, 野生株與突變體注:“*”表示野生酵母中處理組與對照組間的差異顯著性(*P<0.05, **P<0.01);“&”表示相同濃度砷處理組間突變株與野生株間的差異顯著性(&P<0.05,&&P<0.01)圖1 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞生長的影響A, WT strain; B, WT and mutant strainsNote: “*” indicates the significant difference(*P<0.05, **P<0.01) between the control and arsenite treatment groups in WT strain; “&” indicates the significant difference (&P<0.05,&&P<0.01)in the mutants compared to the WT strain at the same arsenite treatment groupsFig.1 Effect of NaAsO2 on yeast cell growth

2.3 SOD1、SOD2基因缺失對亞砷酸鈉誘導(dǎo)酵母細(xì)胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步驗證SOD1和SOD2基因在亞砷酸鈉脅迫過程的作用,采用Annexin V/PI雙染法研究了釀酒酵母SOD1、SOD2基因缺失對亞砷酸鈉誘導(dǎo)酵母細(xì)胞凋亡的影響。從圖3可以看出,對照組中野生株與突變株間早期凋亡率無顯著差異(P>0.05);經(jīng)1 mmol/L亞砷酸鈉脅迫24 h后,所有菌株細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05),而突變株Δsod1和Δsod2細(xì)胞早期凋亡率分別為野生株的1.82倍和1.28倍,均顯著高于野生株細(xì)胞(P<0.05)。結(jié)果說明,亞砷酸鈉可誘導(dǎo)酵母細(xì)胞發(fā)生凋亡,而SOD1和SOD2基因在亞砷酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用。

2.4 SOD1、SOD2基因缺失對亞砷酸鈉引起酵母細(xì)胞ROS水平和線粒體膜電位變化的影響

用1 mmol/L亞砷酸鈉脅迫酵母細(xì)胞24 h后,采用DCFH-DA和Rh123特異性熒光探針檢測胞內(nèi)ROS水平和線粒體膜電位(圖4)。經(jīng)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞熒光強(qiáng)度均明顯高于對照組(P<0.05)。胞內(nèi)ROS水平檢測結(jié)果顯示,在亞砷酸鈉處理組中,所測菌株胞內(nèi)ROS水平均顯著高于對照組(P<0.05),突變株Δsod1胞內(nèi)ROS水平為野生株的2.98倍,兩者間具有顯著差異(P<0.05)。線粒體膜電位檢測結(jié)果顯示,酵母細(xì)胞經(jīng)亞砷酸鈉脅迫后,所測菌株中線粒體膜電位均顯著下降,其中突變株Δsod1顯著低于野生株(P<0.05);ROS水平和線粒體膜電位在Δsod2突變株與野生株間均無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果說明,亞砷酸鈉可誘導(dǎo)酵母胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,引起線粒體膜電位下降,而SOD1基因可有效降低亞砷酸鈉引起的胞內(nèi)ROS水平,并在維持細(xì)胞線粒體膜電位中起重要作用。

注:“*”表示野生酵母中處理組與對照組間的差異顯著性(*P<0.05, **P<0.01);“&”表示相同濃度砷處理組間突變株與野生株間的差異顯著性(&P<0.05,&&P<0.01)圖2 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞存活率的影響Note: “*” indicates the significant difference(*P<0.05, **P<0.01) between the control andarsenite treatment groups in WT strain;“&” indicates the significant difference(&P<0.05,&&P<0.01) in the mutants compared to the WT strain at the same arsenite treatment groupsFig.2 Effect of NaAsO2 on theclonogenic survival rate in yeast cells

A, Annexin/PI 雙染凋亡流式圖; B, 根據(jù)A圖所做注:“*”表示野生酵母中處理組與對照組間的差異顯著性(*P<0.05, **P<0.01);“&”表示相同濃度砷處理組間突變株與野生株間的差異顯著性(&P<0.05,&&P<0.01)圖3 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞凋亡的影響A, Cell apoptosis was measured by Annexin and PI double-staining; B, According to figure ANote: “*” indicates the significant difference(*P<0.05, **P<0.01)between the control and arsenite treatment groups in WT strain; “&” indicates the significant difference (&P<0.05,&&P<0.01)in the mutants compared to the WT strain at the same arsenite treatment groupsFig.3 Effect of NaAsO2 on cell apoptosis in yeast cells measured by flow cytometry assay

A, 胞內(nèi)ROS水平; B, 線粒體膜電位圖4 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平和線粒體膜電位的影響A, Intracellular ROS levels; B, Mitochondrial membrane potentialFig.4 NaAsO2 induced production of intracellular ROS and disruption of mitochondrial membrane potential (Δψ) in yeast cells

3 討論

已有研究證明,砷化物可抑制小鼠空腸組織的抗氧化物酶活性,引起小鼠空腸氧化損傷和組織結(jié)構(gòu)改變[13];引起植物保衛(wèi)細(xì)胞死亡,并伴隨著胞內(nèi)ROS水平的升高[8],說明氧化應(yīng)激機(jī)制是砷毒性機(jī)制之一。

ROS是一類機(jī)體在有氧代謝過程中產(chǎn)生的活性含氧化合物,在生物正常代謝過程中起重要作用。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時,可引起細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶活性增強(qiáng),以清除體內(nèi)由于外界脅迫產(chǎn)生的過量的ROS,從而維持胞內(nèi)的氧化還原平衡;當(dāng)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過多而來不及清除時,機(jī)體則會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),胞內(nèi)ROS水平升高[14]。胞內(nèi)較高濃度的ROS可導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子功能的破壞,或通過攻擊蛋白質(zhì),使細(xì)胞內(nèi)線粒體膜結(jié)構(gòu)受損,使線粒體膜電位改變,最終引起細(xì)胞凋亡或死亡[15-18]。本實驗中亞砷酸鈉可抑制酵母細(xì)胞生長,細(xì)胞死亡率和凋亡率升高,同時伴隨著胞內(nèi)ROS水平的升高和線粒體膜電位的下降。在相同濃度砷處理組中,Δsod1突變株細(xì)胞存活率和線粒體膜電位均顯著低于野生株,胞內(nèi)ROS水平和細(xì)胞凋亡率均顯著高于野生株;Δsod2突變株凋亡率顯著高于野生株,而其他檢測指標(biāo)與野生株間均無顯著差異。結(jié)果說明,亞砷酸鈉可誘導(dǎo)酵母細(xì)胞發(fā)生依賴于線粒體途徑的細(xì)胞凋亡,且亞砷酸鈉誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡與胞內(nèi)ROS水平相關(guān)。

SOD是體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化物酶,在酵母細(xì)胞中,編碼銅鋅超氧化物歧化酶的SOD1基因和錳超氧化物歧化酶的SOD2基因均可特異性清除胞內(nèi)超氧陰離子,從而降低胞內(nèi)ROS水平,以避免ROS對機(jī)體的損傷作用[19]。張小華等[20]研究發(fā)現(xiàn),SOD基因與高溫、乙醇和高滲透壓等多種脅迫耐受性均密切相關(guān)。我們以Δsod1和Δsod2突變株,以及野生株BY4741為材料,研究亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示,酵母細(xì)胞經(jīng)高濃度亞砷酸鈉脅迫24 h后,本研究所用菌株細(xì)凋亡率均顯著升高;在相同濃度砷處理組中,Δsod1和Δsod2細(xì)胞凋亡率顯著高于野生株,說明SOD基因在亞砷酸鈉脅迫誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞凋亡中起重要作用。

綜上所述,亞砷酸鈉可誘導(dǎo)酵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,線粒體膜電位下降,細(xì)胞發(fā)生凋亡;SOD1和SOD2敲除后,細(xì)胞凋亡率顯著升高。結(jié)果說明,亞砷酸鈉誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS水平升高是酵母細(xì)胞死亡的一個誘因,SOD基因與亞砷酸鈉誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。