王存 劉蕃鑫 惠俊敏 鄒曉川 鄧明川 鄭天平 劉林

摘?要?MicroRNA-141（miRNA-141）的檢測(cè)對(duì)相關(guān)癌癥的早期診斷和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。本研究建立了一種無(wú)酶的生物傳感器，用于高靈敏檢測(cè)miRNA-141。首先，合成了具有多孔結(jié)構(gòu)和良好生物相容性的生物金屬有機(jī)骨架（bio-MOF），通過(guò)離子交換的方式，bio-MOF可以封裝大量亞甲基藍(lán)（MB）信號(hào)分子，并保持其生物活性。其次，利用目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大策略中的催化發(fā)夾自組裝（CHA）、輔助目標(biāo)miRNA-141循環(huán)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，進(jìn)一步提高了傳感器的靈敏度。在1.0×1016～1.0×106 mol/L范圍內(nèi)，目標(biāo)miRNA-141濃度的對(duì)數(shù)與傳感器電化學(xué)信號(hào)呈線性相關(guān)，檢出限為3.3×1017 mol/L（S/N=3）。將此方法應(yīng)用于健康人血清中miRNA-141檢測(cè)，加標(biāo)回收率為99.9%～102.0%（RSD≤2.1%）。此生物傳感器簡(jiǎn)單、可靠、靈敏度高、線性范圍寬，為高靈敏檢測(cè)其它miRNA提供了參考。

關(guān)鍵詞?生物傳感器; 催化發(fā)夾自組裝; 信號(hào)放大策略; MicroRNA-141; 生物金屬有機(jī)骨架; 亞甲基藍(lán)

1?引 言

MicroRNA-141（miRNA-141）是一種具有22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性、單鏈、非編碼RNA，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程[1]。miRNA-141的異常表達(dá)（下調(diào)或上調(diào)）通常與多種癌癥相關(guān)，如乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌等[2]。但是，miRNA-141具有分子量小和超低表達(dá)的特征，難以檢測(cè)。盡管傳統(tǒng)的分析方法，如Northern印跡雜交法[3]、熒光法[4]、微陣列分析法[5]和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）[6]等，可以定量檢測(cè)miRNA-141，但這些方法通常存在費(fèi)用高、耗時(shí)長(zhǎng)、樣品前處理過(guò)程繁瑣和儀器操作步驟復(fù)雜等問題[7]。電化學(xué)生物傳感器具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單和背景信號(hào)低等優(yōu)點(diǎn)[8]，在檢測(cè)微量甚至痕量miRNA-141方面效果良好。Mo等[7]以Mn摻雜的CdS@ZnS量子點(diǎn)和卟啉錳（MnPP）為信號(hào)探針和敏化劑，結(jié)合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）信號(hào)放大策略，構(gòu)建了無(wú)酶生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA-141的高靈敏檢測(cè)，檢出限達(dá)到3.3×1012 mol/L。Liu等[9]以9，10-二苯基蒽（DPA）納米立方體為信號(hào)探針，將DNA納米機(jī)器和目標(biāo)物循環(huán)放大策略相結(jié)合，進(jìn)一步提高了傳感器的靈敏度，該方法具有靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，miRNA-141的檢出限為3.0×1017 mol/L。

生物金屬有機(jī)骨架（bio-MOF），作為金屬有機(jī)骨架（MOF）的一個(gè)新分支，屬于超分子化學(xué)和生物科學(xué)交叉學(xué)科研究范疇[10]。bio-MOF不僅具有MOF的周期性重復(fù)的通道結(jié)構(gòu)、孔徑可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，還具有環(huán)境友好、低毒、良好的生物相容性和獨(dú)特的仿生特性等優(yōu)點(diǎn)[11]。特別是當(dāng)bio-MOF孔徑和形狀與客體分子（如染料分子）相匹配時(shí)，可以將客體固定到bio-MOF骨架內(nèi)?；诖?，bio-MOF已成功應(yīng)用于生物馬達(dá)[12]、藥物輸送[13]、電化學(xué)傳感器[14]、催化[15]和環(huán)境保護(hù)材料[16]等領(lǐng)域。如Chen等[17]將羅丹明封裝到bio-MOF的骨架中，用于二極管發(fā)光。Wang等[18]將熒光染料封裝到bio-MOF中，合成了熒光復(fù)合材料，可作為雙發(fā)射平臺(tái)，識(shí)別不同種類硝基爆炸物。Zhang等[19]通過(guò)調(diào)節(jié)bio-MOF中Tb3+和Eu3+的能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，構(gòu)建了用于檢測(cè)炭疽生物標(biāo)志物的傳感器，具有生物相容性好、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，bio-MOF替換傳統(tǒng)MOF應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器具有重要的理論和實(shí)際研究意義。

近年來(lái)，各種核酸信號(hào)放大策略（如酶輔助的DNA納米機(jī)器[20]和核酸外切酶誘導(dǎo)的目標(biāo)物循環(huán)放大策略[21]等）被用于傳感器的研制中，以提高傳感器的靈敏度。然而，這些酶輔助的核酸信號(hào)放大策略受緩沖液pH值和溫度等因素的影響較大。因此，發(fā)展高效、無(wú)酶、低成本的目標(biāo)物循環(huán)放大策略具有重要意義。催化發(fā)夾自組裝（CHA）作為一種目標(biāo)物循環(huán)放大策略，不需要任何酶的參與即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)放大，具有成本低和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在生物分析和生物傳感領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。Xu等[22]制備了氮化碳納米片-金納米粒子（C3N4-AuNPs）納米復(fù)合材料修飾電極，結(jié)合CHA信號(hào)放大策略，實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA-141的高靈敏檢測(cè)。Zhang等[23]設(shè)計(jì)了基于雙CHA信號(hào)放大策略的傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA-21和miRNA-155的同時(shí)檢測(cè)。

本研究合成了骨架內(nèi)封裝了大量亞甲基藍(lán)信號(hào)分子的bio-MOF復(fù)合材料（MB@bio-MOF），通過(guò)聚乙烯亞胺（PEI）將金納米粒子引入到MB@bio-MOF表面（AuNPs-MB@bio-MOF）。隨后，通過(guò)Au-S鍵將發(fā)夾DNA 1（H1）和DNA 2（H2）分別固定到Au修飾的玻碳電極表面（H1/Au/GCE）和AuNPs-MB@bio-MOF表面（H2/AuNPs-MB@bio-MOF）。己硫醇（HT）封閉H1/Au/GCE中Au的非特異性吸附位點(diǎn)。當(dāng)miRNA-141存在時(shí)，miRNA-141通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)將H1的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，使H1莖部的堿基序列暴露出來(lái)，暴露出來(lái)的堿基序列可以打開H2發(fā)卡結(jié)構(gòu)，H1、H2進(jìn)一步堿基互補(bǔ)配對(duì)可以將miRNA-141替換下來(lái)，使其進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)過(guò)程，如此不斷循環(huán)。目標(biāo)物濃度越大，大量帶有MB信號(hào)分子的AuNPs-MB@bio-MOF復(fù)合材料被引入到電極表面，傳感器的電化學(xué)信號(hào)增大，基于此可實(shí)現(xiàn)miRNA-141的高靈敏檢測(cè)。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

CHI66E電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）。JSM-7800F掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)：玻碳電極（GCE，直徑4 mm）為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極。

腺嘌呤（Adenine，≥99%）、4，4′-聯(lián)苯二甲酸（BPDC，97%）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF，99.5%）、三乙胺（TEA，≥99%）、二水合醋酸鋅（Zn（Ac）2·2H2O，99.99%）、HNO3（99%）、檸檬酸鈉（AA，98%）、亞甲基藍(lán)（MB，≥90%）、聚乙烯亞胺（PEI，50%）和HAuCl4·3H2O（99.9%）購(gòu)自上海阿拉丁試劑公司。其它試劑均為分析純。健康人血清樣品來(lái)源于重慶市第九人民醫(yī)院。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）由Na2HPO4和KH2PO4配制，支持電解質(zhì)為0.1 mol/L KCl。用DNA雜交和保存用緩沖液為含140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2的Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。所有寡聚核苷酸均由上海生工生物工程有限公司提供，具體序列詳見表1。所有發(fā)卡DNA使用之前均在95℃變性5 min，緩慢冷卻到室溫。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?Bio-MOF的制備[17] BPDC（0.1211 g）加入到5 mL DMF中，攪拌15 min，然后加入TEA（4 mmol），繼續(xù)攪拌15 min。完全溶解后，加入腺嘌呤（0.0338 g）、Zn（Ac）2·2H2O（0.1646 g）、HNO3（0.125 mL）、DMF（22 mL）和水（2 mL），持續(xù)攪拌30 min后，將上述混合物轉(zhuǎn)移到50 mL 不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，130℃下反應(yīng)24 h，得到白色的固體。冷卻至室溫，分別用DMF和無(wú)水乙醇離心洗滌5次，所得樣品置于60℃烘箱中干燥6 h，得到白色粉末，記為bio-MOF。

2.2.2?MB@bio-MOF的制備[24] 25 mg bio-MOF置于5 mL 5.0×103 mol/L MB溶液（溶劑為DMF）中，攪拌8 h，用DMF和無(wú)水乙醇各離心洗滌5次后，置于60℃烘箱中干燥6 h，得到藍(lán)色固體，記為MB@bio-MOF。 bio-MOF和MB@bio-MOF復(fù)合材料的制備過(guò)程如圖1所示。

2.2.3?AuNPs的制備[25] 在劇烈攪拌條件下，將1 mL AA（1%）迅速加入到100 mL沸騰的HAuCl4溶液（0.01%）中。持續(xù)攪拌10 min后，溶液變?yōu)榫萍t色，冷卻，于4℃保存，備用。

2.2.4?AuNPs-MB@bio-MOF的制備?將20 μL PEI（1%）加入到1 mL水中，攪拌15 min。將5 mg MB@bio-MOF加入上述溶液中，室溫?cái)嚢? h。12000 r/min離心5 min，除去游離的PEI，將得到的固體重新分散到1 mL PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）中。加入5 mL AuNPs溶液，攪拌30 min，通過(guò)AuN鍵將AuNPs固定到PEI修飾的MB@bio-MOF表面，離心，并重新分散到1 mL PBS中，得到AuNPs-MB@bio-MOF復(fù)合材料，室溫下保存。

2.2.5?信標(biāo)復(fù)合物（H2/AuNPs-MB@bio-MOF）的制備

向1 mL含有5 mg AuNPs-MB@bio-MOF的PBS中加入100 μL發(fā)卡DNA 2（H2，10 μmol/L），4℃下攪拌過(guò)夜，通過(guò)AuS鍵將H2固定到AuNPs-MB@bio-MOF表面，得到H2/AuNPs-MB@bio-MOF復(fù)合物。

2.3?傳感器的構(gòu)建

將GCE依次用0.3和0.05 μm的A12O3粉末打磨、拋光成鏡面，然后分別用無(wú)水乙醇和水超聲清洗，室溫下晾干，浸入1% HAuCl4溶液，0.2 V恒電位沉積30 s，得到納米金修飾電極（Au/GCE）。滴加10 μL 發(fā)卡DNA 1（H1，2 μmol/L），4℃孵育過(guò)夜，通過(guò)AuS鍵將H1修飾到Au/GCE表面。隨后，滴加10 μL己硫醇（HT，20 mmol/L）于電極表面，4℃孵育2 h，封閉Au的非特異性吸附位點(diǎn)（記為H1/Au/GCE）。將不同濃度miRNA-141（10 μL）和上述H2/AuNPs-MB@bio-MOF復(fù)合物（10 μL）先后滴到H1/Au/GCE表面，37℃下分別孵育2 h。miRNA-141濃度越大，電極表面引入的AuNPs-MB@bio-MOF信標(biāo)復(fù)合物越多，傳感器的峰電流響應(yīng)值越大，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-141的靈敏檢測(cè)（見圖2）。

3?結(jié)果與討論

3.1?bio-MOF的表征

由bio-MOF的掃描電鏡圖（圖3）可見，bio-MOF由若干花狀結(jié)構(gòu)的球體組成，直徑約100 μm，此結(jié)果與文獻(xiàn)[12]一致。與陰離子型MOFs相似，本研究合成的bio-MOF骨架同樣帶負(fù)電荷[17，18，25]。其中，內(nèi)源性的二甲銨陽(yáng)離子（DMF分解的產(chǎn)物（CH3）2NH2+）易與外源性陽(yáng)離子發(fā)生離子交換[17，26]。因此，本研究通過(guò)陽(yáng)離子交換實(shí)驗(yàn)將MB封裝到bio-MOF骨架內(nèi)。

采用能量色散X射線光譜（EDX）進(jìn)一步研究bio-MOF的組成及元素質(zhì)量百分比。如圖4所示，bio-MOF由C、N、O和Zn元素組成，質(zhì)量百分比分別為39.05%、5.48%、24.38%和31.10%。結(jié)果表明，bio-MOF成功合成。

采用X射線光電子能譜（XPS）分別研究了MB@bio-MOF和AuNPs-MB@bio-MOF的元素組成。由圖5可見，284.7、398.7、530.4和168.7 eV分別為C1s、N1s、O1s、和S2p的特征峰，1043.7和1020.9 eV屬于Zn2P3特征峰，89.4和92.2 eV屬于Au4f特征峰。結(jié)果表明，MB@bio-MOF和AuNPs-MB@bio-MOF復(fù)合材料成功合成。

3.2?傳感器組裝過(guò)程表征

在5 mmol/L Fe（CN）3/46的溶液中，采用循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）對(duì)不同修飾電極進(jìn)行了表征。由圖6A可知，與裸GCE（曲線a）相比，Au/GCE（曲線b）峰電流值明顯增大，這主要?dú)w因于Au的良好導(dǎo)電性。與H1孵育后，由于帶負(fù)電荷的探針Fe（CN）3/46與相同帶負(fù)電荷H1之間的靜電斥力作用[7]，相比曲線a和b，H1/Au/GCE（曲線c）峰電流值明顯下降。滴加HT封閉Au非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，由于HT導(dǎo)電性差，進(jìn)一步阻礙了電子傳遞，峰電流值繼續(xù)下降（曲線d）。

EIS圖譜主要由高頻區(qū)的半圓和低頻區(qū)的直線組成，分別對(duì)應(yīng)電子轉(zhuǎn)移（或動(dòng)力學(xué)）控制過(guò)程和擴(kuò)散控制過(guò)程，其中半圓直徑大小對(duì)應(yīng)電子轉(zhuǎn)移電阻（Ret）[27]。由圖6B可知，Au/GCE（Ret=37 Ω，曲線b）阻抗小于裸GCE（Ret=73 Ω，曲線a），與H1和HT孵育后，H1/Au/GCE（Ret=570 Ω，曲線c）和HT/H1/Au/GCE（Ret=732 Ω，曲線d）的阻抗值依次增大。EIS圖譜與CV表征結(jié)果一致，表明目標(biāo)電極制備成功。

3.3?可行性實(shí)驗(yàn)

圖7為傳感器在目標(biāo)物miRNA-141存在和不存在條件下的電化學(xué)響應(yīng)曲線。當(dāng)目標(biāo)物不存在時(shí)（曲線a），傳感器沒有明顯的電化學(xué)響應(yīng)。當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)（曲線b和c），在0.231和0.261 V產(chǎn)生一對(duì)明顯的氧化還原峰，且隨著目標(biāo)物濃度增大，峰電流值逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明本方法可用于mRNA-141的檢測(cè)。miRNA-141存在時(shí)，H1的發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開，觸發(fā)CHA循環(huán)，暴露出來(lái)的H1莖部堿基序列可以打開H2發(fā)卡結(jié)構(gòu)，AuNPs-MB@bio-MOF復(fù)合物被引入到電極表面，傳感器出現(xiàn)較強(qiáng)的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。H1、H2進(jìn)一步反應(yīng)，可將miRNA-141替換下來(lái)，使其進(jìn)入下一個(gè)CHA循環(huán)過(guò)程中，以此不斷循環(huán)，提高傳感器的檢測(cè)靈敏度。

3.4?傳感器的分析性能

不同濃度miRNA-141的差分脈沖伏安（DPV）響應(yīng)曲線和線性關(guān)系曲線如圖8所示，隨著miRNA-141濃度增加，DPV峰電流值隨之增大。在1.0×1016～1.0×106 mol/L濃度范圍內(nèi)，miRNA-141濃度與傳感器響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Ip=42.91 + 1.805 lgC（R2=0.992），檢出限為3.3×1017 mol/L（S/N=3）。與其它方法相比，此生物傳感器具有更寬的線性范圍和更高的靈敏度（表2）。

3.5?傳感器的抗干擾能力和穩(wěn)定性

在相同檢測(cè)條件下，通過(guò)比較空白樣品、目標(biāo)miRNA-141、干擾物質(zhì)（凝血酶（TB）、miRNA-182-5P、miRNA-21和miRNA-155）和混合樣品（由目標(biāo)miRNA-141和干擾物質(zhì)組成）的峰電流值大小，考察傳感器的抗干擾能力。由圖9可知，1.0×109 mol/L干擾物質(zhì)的響應(yīng)電流值與空白樣品相近，分別為1.0×1016 mol/L 目標(biāo)miRNA-141檢測(cè)信號(hào)的15.9%、21.3%、5.0%和10.1%。相反，目標(biāo)miRNA-141和混合樣品（由1.0×109 mol/L干擾物質(zhì)和1.0×1016 mol/L miRNA-141組成）的響應(yīng)電流值明顯增大，表明所制備的傳感器具有較高的選擇性。此外，考察了傳感器的穩(wěn)定性。連續(xù)測(cè)量8次后，傳感器峰電流值沒有明顯變化（RSD=0.7%），表明此傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

3.6?實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)健康人血清樣品中的miRNA-141進(jìn)行檢測(cè)，考察此生物傳感器的實(shí)用性。將人血清樣品（重慶市第九人民醫(yī)院提供，患者均知情同意）離心10 min，取上清液，用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）稀釋50倍。分別將1.00×1017 mol/L，1.00×1016mol/L和1.00×1010 mol/L的miRNA-141加入到處理好的血清樣品中，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。 miRNA-141的回收率在99.9%～102.0%之間，RSD≤2.1%，表明此傳感器具有良好的實(shí)用性。

4?結(jié) 論

基于生物金屬有機(jī)骨架封裝MB復(fù)合材料和目標(biāo)物循環(huán)擴(kuò)增策略，構(gòu)建了用于高靈敏檢測(cè)miRNA-141的生物傳感器。通過(guò)bio-MOF固載大量MB信號(hào)分子并保持其生物活性，結(jié)合目標(biāo)物循環(huán)擴(kuò)增策略，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，提高傳感器靈敏度。此傳感器為各種miRNA的高靈敏檢測(cè)提供了平臺(tái)，有望為癌癥等重大疾病的早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)提供參考。

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