顧 佳，李 浩，安瑞朋，劉 剛，王冬梅

（華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室/河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室/河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河北 保定 071001）

類受體蛋白激酶（Receptor-like protein kinases，RLKs）是植物蛋白激酶家族中最大的家族，在跨膜信號傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用。富含半胱氨酸的類受體激酶（Cysteine-rich receptor-like kinases, CRKs）是RLKs 中最大的亞家族。典型的CRKs 胞外含有2 個具有抗菌活性的DUF26 結(jié)構(gòu)域（Domain of unknown function 26, DUF26）［1］，DUF26 結(jié)構(gòu)域包含3 個半胱氨酸（C-Xn-C-X2-C）的保守序列，可能作為氧化還原調(diào)節(jié)的潛在靶標(biāo)，表明CRKs 可能會受到活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的調(diào)節(jié)，而ROS 是植物響應(yīng)多種逆境脅迫共同的信號分子，這意味著CRKs 可能在多種脅迫應(yīng)答中起重要作用。

目前對模式植物擬南芥中CRKs 的研究較多，通過T-DNA 插入序列集合的大規(guī)模細胞組學(xué)分析，確定了與氧化應(yīng)激相關(guān)的AtCRK 的主要作用［2］。AtCRK6 和AtCRK7 均參與胞外氧化脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［3］。AtCRK13 的上調(diào)導(dǎo)致與細胞死亡相關(guān)的超敏反應(yīng)，并誘導(dǎo)對病原體的防御［4］。AtCRK28過表達增加擬南芥抵抗丁香假單胞菌的能力［5］。AtCRKs 的研究成果引起了對該基因家族的極大關(guān)注，近幾年，人們逐漸增加了對不同農(nóng)作物抵抗病原菌侵染過程中CRKs 功能的研究。大麥HvCRK1在感染白粉菌后高表達，瞬時沉默HvCRK1 增強了大麥抵御白粉菌的能力，表明HvCRK1 在大麥抵抗白粉菌侵染過程中發(fā)揮負調(diào)控作用［6］。沉默OsCRK1 后獲得的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出明顯的感病性狀，表明OsCRK1 正調(diào)控水稻對白葉枯病菌的抗 性［7］。同時，六倍體小麥中CRKs 的功能研究也已經(jīng)展開，試驗證明TaCRK1 在抗病品種CI12633 受到紋枯病菌侵染時有較高水平的表達［8］。以上研究表明CRKs 在植物應(yīng)答生物或非生物脅迫過程中起到了至關(guān)重要的作用。

在研究小麥抵抗葉銹菌侵染的抗病機制過程中，本實驗室通過RNA-Seq 分析分離克隆了小麥中富含半胱氨酸的類受體激酶2（Cysteine-rich receptorlike kinases2, TaCRK2），利用VIGS 和RNAi 技術(shù)沉默TaCRK2 后導(dǎo)致小麥抵御葉銹菌的能力降低［9］，借助串聯(lián)親和純化-質(zhì)譜鑒定（TAP-MS）技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了1 個TaCRK2 潛在的互作蛋白即翻譯控制腫瘤蛋白（Translationally controlled tumor proteins，TCTP）。但對于TaCRK2 與TaTCTP 的相互作用缺乏試驗驗證。

TCTP 是一種廣泛存在于植物、動物和酵母等真核生物中且高度保守的親水蛋白，在細胞內(nèi)、外均能發(fā)揮作用，對細胞的增殖、分化和凋亡起調(diào)控作用，參與細胞免疫應(yīng)答等［10-12］。AtTCTP 的過表達抑制了BAX 蛋白誘發(fā)的細胞程序性死亡，表明其參與了對細胞程序性死亡的調(diào)控［13］。另外，Meng 的研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜TCTP 基因超表達會導(dǎo)致黃瓜對白粉病的抗性降低，表明其對白粉病起負調(diào)控作用［14］。在小麥中對TCTP 也有了初步的認識，TaTCTP 正調(diào)控小麥抵抗葉銹菌侵染的過程［15］。雖然利用TAP-MS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)了TaTCTP 是TaCRK2 的互作蛋白，但對TCTP 互作蛋白的研究還鮮有報道。本試驗利用DUALmembrane系統(tǒng)酵母雙雜交（DUALmembrane system yeast-twohybrid）和雙分子熒光互補（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）試驗驗證兩者間的相互作用。

本研究使用的DUALmembrane 系統(tǒng)不同于可溶性蛋白質(zhì)間相互作用驗證的酵母雙雜交系統(tǒng)［16-17］。DUALmembrane 系統(tǒng)是利用分裂泛素機制來檢測細胞內(nèi)自然環(huán)境中膜整合蛋白或膜相關(guān)蛋白間或與其他蛋白質(zhì)間的相互作用，能夠在膜上原位檢測到發(fā)生相互作用的蛋白。Zhang 等人利用DUAL 膜系統(tǒng)從感染甘蔗花葉病毒的植株中篩選并檢測到與SCMV-6K2 相互作用的蛋白［18］。本實驗室前期工作已經(jīng)證明TaCRK2 定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上［9］，因此利用DUALmembrane 系統(tǒng)可以更準(zhǔn)確的驗證TaCRK2 與TaTCTP 的相互作用。

借助DUALmembrane 系統(tǒng)酵母雙雜交、BiFC試驗驗證TaCRK2 與TaTCTP 二者間的相互作用，有助于進一步了解TaCRK2 在小麥與葉銹菌互作過程中的作用機制，對揭示小麥抗葉銹病的機理及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制具有重要意義。

1 材料方法

1.1 植物和葉銹菌材料

小麥（Triticum aestivum L.）近等基因系TcLr26與本生煙草（Nicotiana benthamiana）均為本實驗室長期保存的材料。小麥葉銹菌（Puccinia triticina）生理小種260 與TcLr26 組成不親和組合，利用感病品種‘鄭州5389’進行小麥葉銹菌的繁殖。

TcLr26 小麥幼苗在23 ～25 ℃的溫室中培養(yǎng)，7 日齡TcLr26 接種小麥葉銹菌生理小種260。根據(jù)Qiao［19］的方法種植小麥及接種葉銹菌。本生煙草在23 ～25 ℃ 的溫室中培養(yǎng)大約30 d，可以注射農(nóng)桿菌，進行雙分子熒光互補試驗，根據(jù)Sparkes［20］的方法種植 煙草。

1.2 試驗引物合成

利 用primer premier 5.0 軟 件， 根 據(jù)TaCRK2 （GenBank 登錄號： MK424819）核苷酸序列，設(shè)計出具有Sfi I 限制性位點的基因特異性引物Y2HTaCRK2 F/R 和具有Sal I 和Kpn I 限制性位點的基因特異性引物BiFC-TaCRK2 F/R。根據(jù)TaTCTP（GenBank 登錄號：542949）核苷酸序列，設(shè)計出具有Sfi I 限制性位點的基因特異性引物Y2HTaTCTP F/R 和具有Sal I 和Kpn I 限制性位點的基因特異性引物BiFC-TaTCTP F/R。除 M13 F/R 外，其余引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

1.3 目的序列的擴增

在7 日齡小麥葉片表面接種Puccinia triticina生理小種260，在接種48 h 時取樣，利用Trizol (生工，上海)的方法提取總RNA，依據(jù)TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa，大連)合成cDNA。以該cDNA 為模板，利用引物TaTCTP F/R，使用高保真酶PrimeSTAR?Max DNA Polymerase (TaKaRa，大連) 擴增得到TaTCTP 的編碼區(qū)，長度為507 bp，連接至克隆載體pEASY-T1 (全式金，北京) 上，利用引物M13F/R 篩選陽性克隆，測序由北京華大基因股份有限公司完成。通過5’RACE 技術(shù)克隆得到TaCRK2 編碼區(qū)全長1 482 bp［9］。

表 1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the study

1.4 重組表達載體的構(gòu)建

為構(gòu)建TaCRK2 和TaTCTP DUALmembrane 系統(tǒng)酵母雙雜交載體，使用具有Sfi I 限制性位點的基因特異性引物Y2H-TaCRK2 F/R 和Y2H-TaTCTP F/R (表1)，擴增TaCRK2 和TaTCTP 的編碼序列，將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒 (生工，上海) 回收目的片段，目的片段與載體pPR3-N 和pBT3-N 經(jīng)Sfi I 進行酶切后，用Solution I DNA 連接酶進行連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 (Escherichia coli) DH5α 感受態(tài)細胞。對得到的陽性克隆進行酶切驗證和測序。測序結(jié)果用DNAMAN 軟件進行比對分析。

為構(gòu)建TaCRK2 和TaTCTP 雙分子熒光互補載體，使用具有Sal I 和Kpn I 限制性位點的基因特異性引物BiFC-TaCRK2 F/R 和BiFC-TaTCTP F/R（表1），擴 增TaCRK2 和TaTCTP 的編碼序列。過程與構(gòu)建DUAL- membrane 系統(tǒng)酵母雙雜交載體相同，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌（GV3101）中。

1.5 DUALmembrane 系統(tǒng)酵母雙雜交

使用PEG/LiAc 法轉(zhuǎn)化酵母NMY51。pPR3-N和pBT3-N 為 空 載 體 對 照、pPR3-N 和pBT3-NTaCRK2、pPR3-N 和pBT3-N-TaTCTP 為陰性對照，檢測2 個基因的自激活。pPR3-N-TaTCTP 和pBT3-N-TaCRK2 共 轉(zhuǎn) 化、pPR3-N-TaCRK2 和pBT3-NTaTCTP 共轉(zhuǎn)化作為試驗組。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到NMY51 酵母感受態(tài)細胞中，菌液涂布于缺陷型二缺 (SD/-Leu/-Trp) 培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)3 d ，挑取較大的單個菌斑到二缺液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)，直至OD546大約為0.6，用雙蒸水稀釋至OD546為0.2，稀釋后的菌液點在二缺、三缺 (SD/-Leu/-Trp/-His) 和四缺 (SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade) 的培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)3 ～4 d 后觀察并拍照。

1.6 雙分子熒光互補

在煙草葉片中，將含有目的基因的重組質(zhì)粒瞬時表達。對分別攜帶有pSPYNE、pSPYCE、pSPYNE-TaCRK2、pSPYCE-TaCRK2、pSPYNETaTCTP 和pSPYCE-TaTCTP 重 組 質(zhì) 粒 的GV3101農(nóng)桿菌進行過夜培養(yǎng)，4 000 r/min，15 min 離心，所得菌體用侵染緩沖液（10.06 g/L MES、0.76 g/L Na3PO4、5 g/L 葡萄糖、0.1 mmol/L AS）洗滌，再用侵染緩沖液重懸菌體，調(diào)OD600值約為0.6。將攜帶有pSPYNE 和pSPYCE-TaCRK2、pSPYNETaCRK2 和 pSPYCE、pSPYNE 和 pSPYCETaTCTP、pSPYNE-TaTCTP 和pSPYCE、pSPYNETaCRK2 和pSPYCE-TaTCTP、pSPYNE-TaTCTP 和pSPYCE-TaCRK2 的農(nóng)桿菌均按1∶1 的比例混合，然后注射煙草，在48 h 后使用激光掃描共聚焦顯微鏡（OLYMPUS FV1000，日本）進行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DUALmembrane 系統(tǒng)酵母雙雜交載體的構(gòu)建

以pPR3-N 和pBT3-N 為載體，使用單酶切連接法構(gòu)建DUALmembrane 系統(tǒng)酵母雙雜交載體。使用引物Y2H-TaCRK2 F/R 擴增TaCRK2 編碼區(qū)，使用引物Y2H-TaTCTP F/R 擴增TaTCTP 編碼區(qū)。用Sfi Ⅰ將目的基因和表達載體pPR3-N 和pBT3-N酶切，用連接酶進行連接、轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細胞中。在大約1 482 bp（圖1-a, b）和507 bp（圖1-c, d）處檢測到目的條帶，結(jié)果表明TaCRK2 和TaTCTP基因的DUALmembrane 系統(tǒng)酵母雙雜交載體構(gòu)建成功。

圖1 DUALmembrane 系統(tǒng)酵母雙雜交載體的酶切鑒定Fig. 1 Restriction enzyme digestion of the DUALmembrane system yeast two-hybrid vectors

2.2 雙分子熒光互補載體的構(gòu)建

使用引物BiFC-TaCRK2 F/R 擴增帶Sal I 和Kpn I 酶切位點的TaCRK2 編碼區(qū)，使用引物BiFCTaTCTP F/R 擴 增 帶Sal I 和Kpn I 酶 切 位 點 的TaTCTP 編碼區(qū)。將目的基因TaCRK2 和TaTCTP 與表達載體pSPYNE 和pSPYCE 用Sal I 和Kpn I 雙酶切，用連接酶進行連接、轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細胞中。結(jié)果顯示，在大約1 482 bp（圖2-a, b）和507 bp（圖2-c, d）處檢測到目的條帶，表明TaCRK2 和TaTCTP 基因的雙分子熒光互補載體構(gòu)建成功。

圖2 雙分子熒光互補載體的酶切鑒定Fig. 2 Restriction enzyme digestion of the bimolecular fluorescence complementary vectors

2.3 TaCRK2 與TaTCTP 相互作用的DUALmembrane系統(tǒng)酵母雙雜交檢測

在SD/-Leu/-Trp（-LW）平板培養(yǎng)基上，pPR3-N 和pBT3-N 空載體、pPR3-N 和pBT3-N-TaCRK2 共轉(zhuǎn)化、pPR3-N 和pBT3-N-TaTCTP 共轉(zhuǎn)化、pPR3-N-TaTCTP 和pBT3-N-TaCRK2 共 轉(zhuǎn) 化、pPR3-NTaCRK2 和pBT3-N-TaTCTP 共轉(zhuǎn)化的酵母均正常生長，并且其生長狀態(tài)基本一致。在SD/-Leu/-Trp/-His（-LWH）培養(yǎng)基上，只有pPR3-N-TaTCTP和pBT3-N-TaCRK2 共 轉(zhuǎn) 化、pPR3-N-TaCRK2 和pBT3-N-TaTCTP 共轉(zhuǎn)化的酵母正常生長（見圖3）。在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade（-LWHA）培養(yǎng)基上的生長狀況與SD/-LWH 平板培養(yǎng)基上的生長狀況基本一致。結(jié)果表明TaCRK2 與TaTCTP 在酵母中發(fā)生了相互作用。

圖3 DUALmembrane 系統(tǒng)酵母雙雜交檢測 TaCRK2 與TaTCTP 的相互作用Fig. 3 DUALmembrane system yeast two-hybrid detection of TaCRK2 and TaTCTP interaction

2.4 TaCRK2 與TaTCTP 相互作用的雙分子熒光互補試驗檢測

在酵母細胞中TaCRK2 與TaTCTP 能發(fā)生相互作用，為了進一步檢測TaCRK2 與TaTCTP 是否會在植物體內(nèi)相互作用，使用雙分子熒光互補試驗驗證TaCRK2 與TaTCTP 在煙草細胞中的相互作用。將 攜 帶TaCRK2 與TaTCTP 的pSPYNE 和pSPYCE載體單獨或共同注射煙草葉片，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，TaCRK2 和TaTCTP 共同轉(zhuǎn)化的煙草下表皮細胞的熒光信號很強，而單獨注射的對照組煙草沒有熒光（圖4），其熒光信號的分布特征與前期對TaCRK2 進行的亞細胞定位結(jié)果極其相似［9］。結(jié)果表明，TaCRK2 與TaTCTP 可以在植物細胞內(nèi)相互作用，由于TaCRK2 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，所以二者的相互作用很可能發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 膜上。

圖4 雙分子熒光互補檢測 TaCRK2 與TaTCTP 的相互作用Fig. 4 Bimolecular fluorescence complementary detection of TaCRK2 and TaTCTP interaction

3 討論與結(jié)論

植物通過識別病原菌效應(yīng)物蛋白，激發(fā)抗病防衛(wèi)反應(yīng)，導(dǎo)致寄主細胞發(fā)生超敏反應(yīng)（Hypersensitive reaction, HR），從而使病原菌的生長受到抑制［21］。已經(jīng)證明Ca2+作為信號分子參與調(diào)控小麥-葉銹菌互作中HR 的發(fā)生［19,22］。然而，Ca2+如何調(diào)控HR 尚不清楚。本課題組前期借助轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)一個受Ca2+調(diào)控的基因TaCRK2，以Ca2+依賴的方式調(diào)控小麥對葉銹菌的抗性［9］。CRK 是RLKs 的亞家族成員，在植物抗病性和細胞死亡中起重要作用。在擬南芥中AtCRK4、AtCRK6 和AtCRK36 的過表達導(dǎo)致對對丁香假單胞菌的抗性增強，并且增強了早期和晚期PTI 反應(yīng)的激活［23］。AtCRK13 過表達也會誘導(dǎo)細胞死亡［5］。但目前人們對CRKs 參與生物脅迫和非生物脅迫的作用機制卻知之甚少。AtCRK36 的過表達植株表現(xiàn)出高敏感性細胞死亡，與BIK1 相互作用，介導(dǎo)ROS 產(chǎn)生，增強氣孔防御［24］。AtCRK28 在擬南芥中過表達增強了對丁香假單孢菌的抗性，在煙草中瞬時表達AtCRK28 可以誘導(dǎo)細胞死亡，AtCRK28 能夠和BAK1-FLS2 復(fù)合體啟動寄主的防衛(wèi)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞死亡［5］。在本試驗中通過DUALmembrane 系統(tǒng)酵母雙雜交和BiFC 試驗證明了TaCRK2 與TaTCTP 之間存在相互作用。

TaCRK2 定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，TaTCTP 定位于細胞質(zhì)和細胞核。通過DUALmembrane 系統(tǒng)酵母雙雜交驗證TaCRK2 與TaTCTP 存在相互作用后，進一步使用BiFC 試驗在活細胞的生理環(huán)境中原位顯示蛋白質(zhì)的相互作用，結(jié)果顯示TaCRK2 與TaTCTP的相互作用可能發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，說明TaTCTP可能在TaCRK2 調(diào)控小麥抵抗葉銹菌侵染誘導(dǎo)HR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中起作用，參與胞質(zhì)內(nèi)信號的傳遞，但二者的上下游關(guān)系仍有待進一步探討。下一步的工作將通過免疫共沉淀技術(shù)進一步證明二者在體內(nèi)存在互作。前期研究表明TaCRK2 的激酶結(jié)構(gòu)域缺少了催化核心域（VIb 和VII）［9］，那么TaCRK2與TaTCTP 相互作用的本質(zhì)，互作位點的特征將是研究的重點。已知TaTCTP 和TaSnRK1 存在相互作用［25］，因此推測TaTCTP 可能作為磷酸化靶標(biāo)，在TaTCTP 和TaCRK2 之間進行信號傳遞，但TaCRK2是否與TaSnRK1 發(fā)生相互作用仍需要試驗驗證，這些問題的澄清將有助于完善TaCRK2 參與小麥抵抗葉銹菌侵染誘導(dǎo)HR 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。在以后研究中將利用VIGS 和RNAi 技術(shù)沉默TaCRK2、TaTCTP 或?qū)⒍咄瑫r沉默，觀察基因沉默對葉銹菌發(fā)育及HR 的影響，對其上下游關(guān)系進行探究；通過位點突變進一步研究TaCRK2 與TaTCTP 相互作用的實質(zhì)。這為闡明TaCRK2 調(diào)控葉銹菌侵染小麥后誘發(fā)HR 的分子機制奠定了重要基礎(chǔ), 亦對全面地闡釋TaCRK2 在植物免疫過程中的作用機制具有重要的理論意義和實踐意義。