陳澤斌，李希楊，阮亞男，徐勝光

(昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214)

植物根系具有許多重要的生理功能，如吸收、合成、分泌、感知等[1]．而限根栽培是指利用一定的物理或生態(tài)方法，通過(guò)控制根系生長(zhǎng)來(lái)控制根系的體積，以及調(diào)節(jié)地上、地下部分、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)過(guò)程的一種栽培方法[2]．目前，限根栽培技術(shù)已應(yīng)用于多種果樹[3]．常見的限根栽培模式有壟式、箱框式和坑式3種[4]．近年來(lái)，在美國(guó)、澳大利亞等國(guó)家推廣的根域干燥和氣控根系技術(shù)，也屬于限根栽培模式[5]．限根栽培可以控制植物生長(zhǎng)，促進(jìn)開花，同時(shí)還可減少土壤耕作中因肥料滲漏對(duì)地下水的污染[6]．目前，關(guān)于限根栽培對(duì)植物根系溫度、光合特性、生物量積累和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)影響的報(bào)道較多．然而有關(guān)限根栽培對(duì)植物根際土壤微生物區(qū)系的影響鮮見報(bào)道，特別是其對(duì)植物根際土壤微生物多樣性的影響機(jī)理尚待闡明．因此，本研究擬在比較兩種栽培方式下，探討萬(wàn)壽菊根際微生物群落組成和分布，旨在為限根栽培技術(shù)增產(chǎn)的產(chǎn)量生理基礎(chǔ)提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

供試萬(wàn)壽菊種子由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉所提供．在溫室內(nèi)穴盤基質(zhì)育苗后，于2018年5月在云南省宣威市落水鎮(zhèn)健康試驗(yàn)田進(jìn)行大田定植，2018年9月進(jìn)行土壤樣品采集及DNA的提取．

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置I1A處理(CK)為非限根栽培，I1AX處理為限根栽培．非限根栽培及限根栽培參照武衍等[7]的方法進(jìn)行．在采摘期，隨機(jī)選擇30株健康的萬(wàn)壽菊，挖掘出根系，采用抖根法[8]采集根際表面附著的土壤，混合后獲得根際土壤樣品．

1.3 土壤DNA的提取

采用DNA提取試劑盒提?。?/p>

1.4 16S rDNA的V4-5區(qū)和ITS1區(qū)的PCR擴(kuò)增及回收

分別用引物515F/926R[9]和ITS1F/ITS2R[10]擴(kuò)增16S rDNA的V4-5區(qū)和ITS1區(qū)．切膠回收目標(biāo)片段，委托上海微基生物有限公司進(jìn)行測(cè)序．

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控、過(guò)濾和拼接，得到有效序列[11]．對(duì)有效序列進(jìn)行OTU聚類分析、物種分類學(xué)分析、多樣性指數(shù)分析和測(cè)序深度檢測(cè)[12]，然后對(duì)各分類水平上的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌和真菌的OTU豐度和α多樣性

根際土壤樣品16S rDNA的V4-5及ITS1區(qū)的Chao1指數(shù)、辛普森指數(shù)、有效序列數(shù)、OTU豐度、香農(nóng)指數(shù)和覆蓋率見表1和表2．結(jié)果表明，文庫(kù)覆蓋了土壤樣品中99.74%以上的細(xì)菌和真菌類群．OTU豐度稀釋曲線的斜率隨著測(cè)序數(shù)量的增加而逐漸減小(圖1和圖2)，表明測(cè)序量足以反映樣品中的物種組成，但依然存在少量低豐度類群沒有被覆蓋．限根栽培后根際土壤細(xì)菌類群的辛普森指數(shù)與非限根栽培相同，香農(nóng)指數(shù)和OTU豐度略低于非限根栽培，說(shuō)明限根栽培對(duì)細(xì)菌類群OTU分布的均勻度無(wú)影響，且略降低了細(xì)菌OTU的豐富度．限根栽培后根際土壤真菌類群的辛普森指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和OTU豐度均高于非限根栽培，說(shuō)明限根栽培提高了真菌類群OTU分布的均勻度和豐富度．

表1 細(xì)菌OTU豐度和α多樣性

表2 真菌OTU豐度和α多樣性

2.2 細(xì)菌類群組成及豐度

從表3可以看出，在門水平方面，變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)是2個(gè)處理共有的優(yōu)勢(shì)門，豐度均大于10%．然而限根栽培后，變形菌門豐度降低2.65%，綠彎菌門豐度降低0.50%，但酸桿菌門豐度增加3.65%，放線菌門豐度降低2.62%，擬桿菌門豐度增加0.17%．

表3 門水平的細(xì)菌相對(duì)豐度

在屬水平方面(表4)，尚未分類的類群(Unclassified)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)、類諾卡氏屬(Nocardioides)、Gaiella屬、硝化螺菌屬(Nitrospira)是2個(gè)處理共有的優(yōu)勢(shì)類群，豐度均大于1%．限根栽培后，尚未分類類群豐度增加5.66%，黃桿菌屬豐度增加1.73%，玫瑰彎菌屬豐度降低0.12%，類諾卡氏屬豐度降低0.71%，Gaiella屬豐度降低0.24%，硝化螺菌屬豐度增加0.07%．

表4 屬水平的細(xì)菌相對(duì)豐度

2.3 真菌類群組成及豐度

在門水平方面(表5)，子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、尚未分類的類群(Unclassified)、接合菌門(Zygomycota)是2個(gè)處理共有的優(yōu)勢(shì)類群，豐度均大于5%．限根栽培后，子囊菌門(Ascomycota)豐度增加3.81%，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)豐度降低4.22%，尚未分類的類群(Unclassified)豐度下降0.35%，接合菌門(Zygomycota)豐度增加1.93%．

表5 門水平的真菌相對(duì)豐度

在屬水平方面(表6)，尚未分類的類群(Unclassified)、Boeremia屬、赤霉菌屬(Gibberella)、被孢霉屬(Mortierella)、毛殼菌屬(Chaetomium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、隱球菌屬(Cryptococcus)在兩種栽培方式中的豐度均大于1%，是2個(gè)處理共同的優(yōu)勢(shì)類群．限根栽培后，尚未分類的類群豐度降低4.83%，Boeremia屬豐度增加15.29%，赤霉菌屬豐度降低4.19%，被孢霉屬豐度增加1.95%，毛殼菌屬豐度增加5.60%，鐮刀菌屬豐度降低0.43%，隱球菌屬豐度增加3.37%．

表6 屬水平的真菌相對(duì)豐度

3 結(jié)論與討論

采用高通量測(cè)序手段，比較萬(wàn)壽菊限根栽培和非限根栽培方式下根際微生物群落組成，發(fā)現(xiàn)限根栽培提高了真菌OTU分布的均勻度和豐富度，降低了細(xì)菌類群OTU的豐富度，但對(duì)細(xì)菌的均勻度無(wú)影響．限根栽培后，土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性指數(shù)高于真菌，這與李巖等[13]的研究成果一致，并與土壤中微生物以細(xì)菌為主有關(guān)[14]．兩個(gè)處理根際土壤中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群與袁鑫等[15]的研究結(jié)果一致，該5個(gè)細(xì)菌門在根際微生物中占有重要地位．限根栽培降低了細(xì)菌類群OTU豐富度，這可能是由于限根栽培后，土壤氮含量升高，土壤酸化，從而使得根際土壤細(xì)菌群落豐度下降[16]．限根栽培后，酸桿菌門、擬桿菌門的相對(duì)豐度增加，而變形菌門、綠彎菌門的相對(duì)豐度降低，這與喬清華等[17]的研究結(jié)果一致．限根栽培后擔(dān)子菌門真菌比例減少，子囊菌門真菌比例增加，這可能是由于限根栽培后根系分泌物大量富集造成了土壤中有機(jī)酸含量升高，從而導(dǎo)致土壤pH下降，使得真菌群落的豐度下降[18]．在細(xì)菌和真菌的各分類水平方面，都檢測(cè)到豐度不等的尚未分類的微生物類群(Unclassified)，推測(cè)是根際土壤中的新微生物種類，這部分序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中找不到相應(yīng)的分類信息，可能是受到測(cè)序技術(shù)的限制．目前，對(duì)該類微生物研究較少，且還未對(duì)其進(jìn)行分類．限根栽培后，芽單胞菌的豐度增加了1.24%，芽單胞菌是典型的植物促生菌，通過(guò)與植物互作，進(jìn)行生物固氮，誘導(dǎo)植物激素分泌，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[19]．扈進(jìn)冬等[20]的研究結(jié)果表明，鏈格孢屬、赤霉菌屬、鐮刀菌屬中的某些種常常會(huì)引起作物真菌性病害．而本研究表明，限根栽培后，赤霉菌屬和鐮刀菌屬的豐度均降低，推測(cè)限根栽培降低了病原真菌在根際土壤中的豐度，減少了病原真菌積累．子囊菌門和擔(dān)子菌門是限根栽培后根際土壤中豐度最高的兩個(gè)門，也是土壤中最豐富的真菌類群．李發(fā)虎等[21]發(fā)現(xiàn)這兩類真菌能促進(jìn)根系生長(zhǎng)．本研究發(fā)現(xiàn)的其他菌群是否與植物健康有關(guān)尚不清楚，還需進(jìn)一步通過(guò)試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證．根際土壤微生物群落復(fù)雜，其群落特征是微生物種群協(xié)同作用的結(jié)果，根際土壤微生物對(duì)植物的影響不能根據(jù)單個(gè)或幾個(gè)種群的變化來(lái)解釋，在后續(xù)研究中還需要進(jìn)行長(zhǎng)期的試驗(yàn)和多方面的觀察，并結(jié)合其他研究者的研究才能進(jìn)一步揭示其對(duì)植物生長(zhǎng)的影響．