慢性HBV感染患者核苷類藥物治療后相應(yīng)突變位點(diǎn)檢測(cè)及效果分析

張永榮

【摘 要】 目的：探析慢性HBV感染患者核苷類藥物治療后相應(yīng)突變位點(diǎn)檢測(cè)方法及效果情況。方法：選取慢性HBV患者207例，實(shí)施實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法擴(kuò)增其血清HBV多聚酶區(qū)，并直接測(cè)序PCR產(chǎn)物。結(jié)果：8例經(jīng)ETV治療患者，共發(fā)生突變類型2種，最為常見的為rtT184A/G/I/S;66例經(jīng)ADV治療患者，共發(fā)生突變類型3種，最為常見的為rtA181V/T/S;5例LdT治療患者，共發(fā)生突變類型2種，最為常見的為rt M204I;128例LAM治療患者中，共發(fā)生突變類型4種，最為常見的為rtV207I/L/G。結(jié)論：多樣化為核苷類四五耐藥株的氨基酸突變特點(diǎn)，根據(jù)基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果，待抗病毒失敗后對(duì)藥物給予及時(shí)更換。

【關(guān)鍵詞】 核苷類似物;慢性HBV感染;相應(yīng)突變位點(diǎn);效果分析

【中圖分類號(hào)】 R512.6 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A ? 【文章編號(hào)】1005-0019（2020）17-221-01 ?本研究以我院接收的慢性HBV感染患者207例為研究對(duì)象，探究核苷類藥物治療后相應(yīng)突變位點(diǎn)檢測(cè)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月-2019年9月收治患者207例，男162例，女45例;（19-81）歲，平均（48.6±3.5）歲。根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)均已確診。檢測(cè)前，分別實(shí)施LdT、ADV、ETV和LAM等核苷類藥物進(jìn)行抗乙肝病毒治療。前一晚禁食，翌日取適量靜脈血為標(biāo)本。

1.2 基因測(cè)序方法

1.2.1 定量PCR擴(kuò)增 真空下取3ml血液為標(biāo)本，離心取50μl血清，加入濃縮提取液50μl，震蕩混勻后，在4℃的環(huán)境下靜置五分鐘，每分鐘15000r，在4℃環(huán)境下離心十分鐘，吸棄上清，加入裂解緩沖液40μl，劇烈震蕩無(wú)沉淀后，予短暫離心，在100℃高溫下加熱十分鐘，15000rpm，在4℃環(huán)境下離心五分鐘，取4μl上清置于25μl反應(yīng)體系中。94℃五分鐘，94℃7秒、60℃50秒、40個(gè)循環(huán)，37℃恒溫保存。

1.2.2 酶解PCR產(chǎn)物 取3μl PCR酶解產(chǎn)物，加入SPA混合物2μl，并將其混合均勻。在37℃下放置1小時(shí)，在80℃下防止15分鐘，最后在4℃下保存。

1.2.3 PCR反應(yīng)預(yù)測(cè) 取3μl PCR酶解產(chǎn)物，測(cè)序產(chǎn)物2μl與測(cè)序試劑1μl實(shí)施PCR擴(kuò)增，96℃1分鐘，96℃10秒、50℃5秒、60℃4分鐘、循環(huán)25次，在4℃恒溫狀態(tài)下保存。

1.2.4 產(chǎn)物純化的測(cè)序 （1）將醋酸鈉-乙醇混合物16μl置于離心管0.2ml內(nèi)，劇烈振蕩，避光靜置15分鐘，按照每分鐘12000r速度離心，在4℃環(huán)境下離心半小時(shí)，將上層液體吸棄。（2）將70%預(yù)冷乙醇70μl置于離心管0.2ml內(nèi)，劇烈震蕩，按照每分鐘12000r速度離心，在4℃環(huán)境下離心15分鐘，把上層液體吸棄。（3）將70%乙醇70μl置于離心管0.2ml內(nèi)，溫和顛倒數(shù)次混勻，按照每分鐘12000r速度離心，在4℃環(huán)境下離心5分鐘，把上層液體吸棄。（4）在室溫下待酒精揮發(fā)干凈后，將Hi-Di Formamide溶解DNA 10μl加入。（5）在PCR以上變性：在94℃環(huán)境下4分鐘，在4℃環(huán)境下4分鐘。上機(jī)進(jìn)行電泳檢測(cè)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件統(tǒng)計(jì)工具，對(duì)研究中涉及的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以百分比形式表示。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)ETV治療的相應(yīng)突變位點(diǎn) 經(jīng)ETV治療的患者中，共發(fā)生突變類型2種，其中最為常見的當(dāng)屬rtT184A/G/I/S（n=5，構(gòu)成比=62.50%），其次為RtS202G/I（n=3，構(gòu)成比=37.50），均為單獨(dú)突變。

2.2 經(jīng)ADV治療的相應(yīng)突變位點(diǎn) 經(jīng)ADV治療的患者中，共發(fā)生突變類型3種，其中最為常見的當(dāng)屬rtA181V/T/S（n=8，構(gòu)成比=12.12%），其次為rtV214A（n=10，構(gòu)成比=15.15%），然后為rtN236T（n=48，構(gòu)成比=72.73%）。

2.3 經(jīng)LAM治療的相應(yīng)突變位點(diǎn) 經(jīng)LAM治療的患者中，共發(fā)生突變類型4種，其中最為常見的當(dāng)屬rtV207I/L/G（n=61，構(gòu)成比=47.66%）。在聯(lián)合突變中，rtLI80M+M204V（n=34，構(gòu)成比=26.56%）的突變率顯著高于rtLI80M+M204I（n=21，構(gòu)成比=16.41%）、rtM204I（n=12，構(gòu)成比=9.38%）。

2.4 經(jīng)LdT治療的相應(yīng)突變位點(diǎn) 經(jīng)LdT治療的患者中，共發(fā)生突變類型2種，其中最為常見的當(dāng)屬rt M204I（n=3，構(gòu)成比=60.00），其次為rtLI80M+M204I（n=2，構(gòu)成比=40.00%）。

3 討論

核苷類藥物是目前臨床治療慢性HBV感染的常用藥，能對(duì)病毒起到一定的抑制作用，但用藥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易致NA耐藥。本研究，在拉米夫定中，M204V/I是主要耐藥突變，能使病毒對(duì)拉米夫定的敏感性有效降低，其余則表示為代償變異，在一定程度上能使M204V/I變異病毒的復(fù)制能力恢復(fù);N236T為阿德福韋主要耐藥突變;T184A/G/I/S為恩替卡韋的主要耐藥突變，M204I為替比夫定的主要耐藥突變。阿德福韋突變屬于二次打擊模式，其突變的構(gòu)建在拉米夫定耐藥變異的基礎(chǔ)上。拉米夫定和替比夫定均為L(zhǎng)-構(gòu)型的核苷類抗病毒藥物，相比拉米夫定其耐藥率相對(duì)偏低[1]。拉米夫定和替比夫定的耐藥位點(diǎn)相似，為逆轉(zhuǎn)錄酶 C 區(qū)的 rt M204I。所以，LAM耐藥者會(huì)出現(xiàn)對(duì)LdT的高度交叉耐藥，在換藥時(shí)，盡量不實(shí)施L-構(gòu)型核苷類抗病毒藥物，建議選用無(wú)環(huán)核苷酸類藥物[2]。

總之，多樣化為核苷類四五耐藥株的氨基酸突變特點(diǎn)，根據(jù)基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果，待抗病毒失敗后對(duì)藥物給予及時(shí)更換。

參考文獻(xiàn)

[1] 顏悅?cè)?，馮繼紅.替諾福韋酯治療核苷酸類藥物耐藥慢性乙型肝炎患者的研究進(jìn)展.臨床肝膽病雜志，2016，32（11）：2182-2185.

[2] 曹輝，張瑋. 核苷類藥物治療慢性乙型肝炎患者影響HBeAg血清轉(zhuǎn)換的免疫學(xué)因素研究進(jìn)展.實(shí)用肝臟病雜志，2017，20（3）：372-376.