呂梓劍　金純伊　鄒吉祥　金　華

低氮脅迫下文冠果轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化

呂梓劍金純伊鄒吉祥金華

（大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院遼寧大連116600）

利用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)兩個(gè)低氮脅迫組( 0.2mM，LN; 0 mM，NN)和正常施氮組(2mM，CK) 處理的文冠果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（PlantTFDB）獲得文冠果在低氮脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果表明，以WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族為例，文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子在氮素缺乏的條件下會(huì)受到強(qiáng)烈的響應(yīng)文章對(duì)以WRKY家族為例對(duì)文冠果低氮脅迫下轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化進(jìn)行了分析。

文冠果；轉(zhuǎn)錄因子；基因表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子是將目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。在特定的信號(hào)誘導(dǎo)下，調(diào)控目的基因表達(dá)并決定其表達(dá)的強(qiáng)弱。

氮素是植物生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素，是作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量形成的首要限制因子。氮素缺乏會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受到限制，甚至導(dǎo)致植株死亡。WRKY作為高等植物中的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物的多種非生物脅迫（如低氮、溫度、干旱等）和生物脅迫，通過(guò)間接或者直接的方式參與調(diào)控，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控植物的各種生理與發(fā)育過(guò)程[1-2]。從甘薯中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)WRKY蛋白之后，研究人員在擬南芥中鑒定出了74個(gè)WRKY基因[3]。據(jù)報(bào)道，WRKY72 突變體在百草枯和低氮處理下主根延伸長(zhǎng)度顯著變短，說(shuō)明WRKY72 對(duì)MV和LN敏感，提示W(wǎng)RKY72 參與調(diào)控活性氧耐受和氮營(yíng)養(yǎng)吸收或利用過(guò)程[4]。通過(guò)對(duì)AtWRKY31 進(jìn)行亞細(xì)胞定位以及轉(zhuǎn)錄活性分析，發(fā)現(xiàn)AtWRKY31 定位于細(xì)胞核，具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，且表達(dá)受熱害、低鉀、低氮等處理顯著的抑制[5]。因此，研究低氮脅迫下的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析是十分必要的。

文冠果（Bunge），無(wú)患子科文冠果屬，文冠果耐干旱、貧瘠、抗逆性強(qiáng)，是中國(guó)特有的一種木本油料樹(shù)種[6]。該研究以兩種低氮脅迫處理下的文冠果為材料，以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)分析了低氮脅迫下文冠果轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化，為探究文冠果在低氮條件下分子響應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 文冠果材料處理及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

選取二月齡的文冠果幼苗葉片作為實(shí)驗(yàn)材料。用改良的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液（進(jìn)行澆灌，每3 d澆灌一次營(yíng)養(yǎng)液。設(shè)置3個(gè)氮濃度：2 Mm（對(duì)照）、0.2 Mm（低氮）和0 Mm（無(wú)氮），處理14 d后采集植物葉片并迅速置于液氮中冷凍，后進(jìn)行RNA提取和RNA-seq測(cè)序。

1.2 文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子鑒定

將文冠果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的178 ,376 條CDS序列，與植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)PlantTFDBv4.0[7]（http://planttfdb_v4.cbi. pku.edu.cn/）進(jìn)行比對(duì)，共得到了1873 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，從中挑選得到WRKY轉(zhuǎn)錄因子。

1.3 文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族聚類熱圖分析方法

使用百邁客云BMKClound[8]中的在線繪圖工具選擇熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

文冠果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序片段經(jīng)Trinity拼接共獲得178 376條CDS序列，將其上傳至植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（PlantTFDBv4.0）進(jìn)行比對(duì)，得到1 873個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分屬于56個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，我們將數(shù)量在前10的轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了整理。其中，C2H2家族最大，共335成員。接下來(lái)依次為ERF、bHLH、GRAS、C3H、bZIP、NAC、MYB-related、WRKY和Trihelix。

表1　文冠果轉(zhuǎn)錄因子的鑒定Top10

2.2 文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的聚類熱圖分析

通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析，得到了所有文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子NN、LN的log2FoldChange，通過(guò)BMKClound在線繪制熱圖工具，得到了文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的聚類熱圖（圖1）?？梢詮膱D中看出，在無(wú)氮的情況下WRKY表達(dá)有高有低有明顯的差異化，通過(guò)與低氮脅迫的比對(duì)來(lái)看，在低氮脅迫的情況下大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)不同于無(wú)氮的差異表達(dá)，說(shuō)明了文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子在氮素更為缺乏的條件下，會(huì)受到更為強(qiáng)烈的響應(yīng)。一些轉(zhuǎn)錄因子在低氮時(shí)比無(wú)氮時(shí)差異表達(dá)變化量要大，這樣的轉(zhuǎn)錄因子還有很多，但是也有極個(gè)別的轉(zhuǎn)錄因子低氮時(shí)比無(wú)氮時(shí)差異表達(dá)變化量要小，這也說(shuō)明了一小部分文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子不會(huì)響應(yīng)低氮脅迫。

圖1　文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的聚類熱圖

3 結(jié)論與討論

文章將從文冠果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出的1 873個(gè)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量前十的家族進(jìn)行了整理，分別為C2H2、ERF、bHLH、GRAS、C3H、bZIP、NAC、MYB-related、WRKY和Trihelix，其中ERF、bHLH、NAC、MYB-related、WRKY在以往報(bào)道中提到與低氮脅迫相關(guān)[9-12]。64個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了聚類熱圖分析表明文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子在氮素缺乏的條件下會(huì)受到強(qiáng)烈的響應(yīng)。通過(guò)對(duì)文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的聚類熱圖分析，發(fā)現(xiàn)文冠果WRKY轉(zhuǎn)錄因子在氮素更為缺乏的條件下，會(huì)受到更為強(qiáng)烈的響應(yīng)。

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省級(jí)大創(chuàng)項(xiàng)目201912026167

金華

S511

A

2095-1205(2020)05-87-02

10.3969/j.issn.2095-1205.2020.05.42