楊同香 - 吳孔陽(yáng) - 白云飛 - 陳俊亮 - 萬(wàn)蘇艷 - 楊如夢(mèng) -

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2. 洛陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471934；3. 河南三劍客農(nóng)業(yè)股份有限公司，河南 漯河 462000)

果膠酶是水解酶家族的成員，是一類(lèi)能夠降解果膠分子的多種酶的總稱(chēng)，包括聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)、果膠酯酶(pectin esterase，PE)和果膠酸裂解酶(pectate lyase，PL)等[1]。果膠酶在全球食品酶制劑市場(chǎng)中占有25%的份額，另外在紡織工業(yè)、造紙工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、廢水處理、動(dòng)物飼料生產(chǎn)及原生質(zhì)體融合等諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2]。果膠酶廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)。由于受原料、提取工藝及季節(jié)等諸多因素限制，果膠酶主要由微生物發(fā)酵制備。與許多其他工業(yè)酶一樣，果膠酶在生產(chǎn)中也面臨逐步提高產(chǎn)量、生產(chǎn)率等問(wèn)題[3]。目前，中國(guó)對(duì)微生物果膠酶開(kāi)展了廣泛的研究，但是缺乏較為系統(tǒng)的分析和概況。鑒于此，文章就高產(chǎn)果膠酶菌株的篩選、育種技術(shù)、影響產(chǎn)酶因素、酶的生化性質(zhì)以及酶的固定化進(jìn)行綜述，以期進(jìn)一步推動(dòng)果膠酶的理論和應(yīng)用研究。

1 高產(chǎn)果膠酶菌株的篩選

微生物果膠酶的來(lái)源廣泛，細(xì)菌、放線菌及真菌等均能產(chǎn)生。由于果膠分子主要是α-1,4連接的D-半乳糖醛酸殘基組成[4]，因此分離培養(yǎng)基中的碳源通常是果膠，且作為唯一碳源。目前報(bào)道篩選產(chǎn)果膠酶菌株的方法主要有剛果紅法、碘試劑法和溴酚藍(lán)法。例如，Zhou等[5]以果膠為唯一碳源，平板培養(yǎng)后經(jīng)剛果紅染色篩選，從煙葉中分離得到一株果膠酶活力高的菌株BacillussubtilisPB1。但也有學(xué)者[6-7]使用了其他試劑進(jìn)行篩選，例如，譚秀華[6]在菌落周?chē)尤?% CTAB，靜置15 min后，通過(guò)觀察是否有無(wú)色透明圈產(chǎn)生來(lái)篩選果膠酶產(chǎn)生菌，并得到一株枯草芽孢桿菌。另外利用釕紅也可以輔助篩選果膠酶產(chǎn)生菌[8-10]。當(dāng)然，研究人員[11-13]也可以不借助指示劑或染料所形成的透明圈、變色圈等進(jìn)行篩選，還可以通過(guò)直接測(cè)定果膠酶活性來(lái)篩選。例如，寧振興等[11]在含有廣西六堡茶的蔗糖察氏液體培養(yǎng)基分離純化菌株，并通過(guò)測(cè)定果膠酶和纖維素酶活性，篩選得到一株能高效降解梗絲果膠和纖維素的塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)。對(duì)于想要獲得某一特定類(lèi)群的微生物時(shí)，往往在培養(yǎng)基中加入抗生素來(lái)抑制其他微生物的生長(zhǎng)。例如，Haile等[14]在分離具有果膠酶活性的酵母菌時(shí)，在YPDA培養(yǎng)基中加入0.01%的青霉素來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，并篩選得到多株具有果膠酶活性的酵母菌，如表1中所示。而楊斯超[15]則通過(guò)在YPD培養(yǎng)基中加入鏈霉素和氯霉素來(lái)抑制細(xì)菌，并篩選得到一株產(chǎn)果膠酶的酵母菌PPY-1。

從上述篩選的菌株以及表1中展示的微生物類(lèi)型可以看出，目前報(bào)道的果膠酶產(chǎn)生菌主要以絲狀真菌和芽孢桿菌為主，也有學(xué)者[16-17]發(fā)現(xiàn)一些酵母菌和歐文氏菌產(chǎn)果膠酶。對(duì)于低溫果膠酶菌株的篩選，學(xué)者們[18-19]也開(kāi)展了相關(guān)研究。例如，在南極海綿中發(fā)現(xiàn)的南極真菌Geomycessp F09-T3-2，在低溫條件下表現(xiàn)出較高的果膠酶活性，表明該菌株在低溫果膠酶領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值[18]。總的來(lái)說(shuō)，在分離產(chǎn)果膠酶菌株時(shí)，要結(jié)合各種方法的特點(diǎn)和試驗(yàn)條件進(jìn)行篩選。比如剛果紅染色法，一般果膠用量少，靈敏度高，難點(diǎn)是要控制好染色時(shí)間，而CTAB法則是果膠用量大，使用受限。

表1 近5年報(bào)道產(chǎn)果膠酶的菌株

2 果膠酶菌株的育種

2.1 誘變育種

誘變育種是目前工業(yè)菌種選育常用的方法，盡管常規(guī)的物理或化學(xué)誘變方法工作量大，育種效率稍低，但仍然是果膠酶高產(chǎn)菌株選育的重要方式[33]。通過(guò)這些方式獲得的高產(chǎn)突變菌株，其酶活性較出發(fā)菌株均有較大幅度提高，其中杜國(guó)軍等[34]采用亞硝酸—紫外線對(duì)黑曲霉HY-D3進(jìn)行誘變處理，突變株HY-LL3酶活力達(dá)到了3 124 U/g，提高了3.59倍。同樣黃丹梅等[35]采用紫外線對(duì)黑曲霉菌株誘變，突變株的酶活力提高了3倍。此外，微波誘變方法可以獲得高產(chǎn)果膠酶菌株。例如，何海燕等[36]利用微波照射誘變處理棘孢曲霉D80菌株，篩選出一株酶活力大幅度提高的正突變菌株DW75，是出發(fā)菌株D80酶活的2.47倍。

值得提出的是，近年來(lái)新發(fā)展的常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)誘變育種技術(shù)已成功應(yīng)用于細(xì)菌和真菌等微生物，在生物育種領(lǐng)域應(yīng)用上表現(xiàn)出十分出色的誘變效果，具有突變快、突變多樣性高、簡(jiǎn)單易行等優(yōu)勢(shì)，已成為高效快速誘變微生物基因組的有效方法之一[37-38]，而目前利用該技術(shù)來(lái)選育果膠酶菌株還鮮有報(bào)道，今后可以嘗試將其作為果膠酶菌株選育的一種策略。

2.2 基因工程育種

為提高果膠酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶水平，學(xué)者們嘗試?yán)没蚬こ碳夹g(shù)開(kāi)展果膠酶菌種的選育。目前應(yīng)用于果膠酶工程菌構(gòu)建的系統(tǒng)主要是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)。其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前表達(dá)外源蛋白的首選，例如，Yuan等[39]將多黏類(lèi)芽孢桿菌KF-1果膠酸裂解酶基因PpPel9a在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，以PGA作為底物，其最高酶活力達(dá)到(117.40±4.82) U/mg。Tang等[40]將馬賽屬細(xì)菌M.eurypsychrophila果膠酸裂解酶基因pel1克隆，在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)，以0.2%的PGA為底物，其比活力達(dá)到78.75 U/mg。Liu等[41]選擇大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)了來(lái)源于枯草芽孢桿菌JL-13果膠酸裂解酶基因，結(jié)果重組酶比活力高達(dá)(197.40±5.20) U/mg。Zhou等[42]利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了來(lái)自克勞氏芽孢桿菌BacillusclausiiS10果膠酸裂解酶基因的過(guò)量表達(dá)，其比活力高達(dá)675.5 U/mg。而同樣的表達(dá)系統(tǒng)過(guò)量表達(dá)地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis91果膠酸裂解酶，其比活力最高為320 U/mg。相比較于原核表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展則較為緩慢。但隨著對(duì)其表達(dá)機(jī)制的深入研究，來(lái)源于高等生物的基因更適合于真核生物表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)。比如Aspergillusluchuensisvar.saitoi果膠酸裂解酶基因AsPelA，研究人員將其克隆并在畢赤酵母KM71H中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)熱處理后重組酶還能達(dá)到未處理前64%的酶活力[43]。此外，研究人員還嘗試了將微生物源果膠酶基因在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的研究，莫健新等[44]通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的攜帶有微生物源果膠酶基因pg5a、pgI、pga3A和pgaA的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入豬PK15細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種果膠酶基因均能在豬PK15細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出mRNA，但只有pg5a和pgI可以表達(dá)出有活性的果膠酶，最高酶活為0.95 U/mL。

2.3 分子定向進(jìn)化育種

利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)、酶工程等技術(shù)對(duì)酶進(jìn)行合理的改造，成為進(jìn)一步提高酶活性和穩(wěn)定性的重要手段，也成為獲得具有商業(yè)價(jià)值酶的潛在途徑[45]?？蒲腥藛T[46]從芽孢桿菌Bacillussp. N16-5果膠酸裂解酶基因(spPelA)出發(fā)，通過(guò)易錯(cuò)PCR構(gòu)建隨機(jī)突變體文庫(kù)，經(jīng)過(guò)兩輪易錯(cuò)PCR，從上萬(wàn)個(gè)突變體中篩選出10個(gè)熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的突變體，其中熱穩(wěn)定性好的組合突變體EAET較野生型Bacillussp. N16-5果膠酸裂解酶酶活性增加了140倍。Wang等[45]采用易錯(cuò)PCR對(duì)來(lái)源于Bacillussubtilis168果膠酸裂解酶基因進(jìn)行隨機(jī)突變體文庫(kù)構(gòu)建，利用高通量篩選方法分離出5個(gè)果膠酸裂解酶活力較高的突變體。與Bacillussubtilis168果膠酸裂解酶相比，突變體K47E的活力最高。此外，該研究還結(jié)合點(diǎn)飽和突變技術(shù)進(jìn)一步篩選，獲得的K47D/V132F酶活力更高，其比活力是Bacillussubtilis168的3.9倍。不僅如此，通過(guò)點(diǎn)飽和突變和隨機(jī)突變技術(shù)處理短小芽孢桿菌Bacilluspumilus(ATCC 7061)時(shí)，也取得了滿意效果。

除上述育種方法外，DNA改組技術(shù)(DNA shuffling)也被應(yīng)用于果膠酶菌株的改造。例如，Yu等[47]將出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌ZGL14進(jìn)行紫外—60Co輻射誘變處理，以獲得的5株突變株和ZGL14為親本菌株進(jìn)行融合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)兩輪DNA改組技術(shù)，得到一株酶活力達(dá)到499 U/mL的突變株FS105，其酶活力較出發(fā)菌株提高了1.6倍。

3 影響果膠酶產(chǎn)量的因素

在工業(yè)酶制劑生產(chǎn)上，主要通過(guò)固態(tài)發(fā)酵和液體深層發(fā)酵技術(shù)完成，目前所報(bào)道的果膠酶生產(chǎn)亦是如此。近年來(lái)，果膠酶的固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)深層發(fā)酵均有報(bào)道。除菌株自身差異外，外部環(huán)境條件對(duì)果膠酶的發(fā)酵生產(chǎn)影響較大，主要包括培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件和方式等。

3.1 培養(yǎng)基組成

目前工業(yè)上果膠酶生產(chǎn)菌主要是黑曲霉，作為食品級(jí)果膠酶的生產(chǎn)菌株，其安全性也得到普遍認(rèn)可。另外在培養(yǎng)基優(yōu)化方法選擇上，響應(yīng)面優(yōu)化方法應(yīng)用較為廣泛[17, 48-50]。另外在基質(zhì)選擇上，廉價(jià)的麩皮往往會(huì)成為果膠酶生產(chǎn)的重要原料[51]。Bibi等[29]以農(nóng)副廢棄物粗級(jí)提取的木聚糖和果膠、麩皮和桔皮為底物，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化了BacilluspumilusAJK液體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶和果膠酶條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在最適底物濃度下，木聚糖酶和果膠酶或性最高分別達(dá)到(415.22±18.50)，(109.10±8.80) IU/mL，進(jìn)一步分析得出，該菌株具有多種果膠酶活性，其中外切聚甲基半乳糖醛酸酶18.98 IU、內(nèi)切聚甲基半乳糖醛酸酶0.14 IU，外切多聚半乳糖醛酸酶80 IU，內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶0.28 IU，聚甲基半乳糖醛酸裂解酶1.42 IU，聚半乳糖醛酸裂解1.47 IU以及果膠酯酶0.15 IU。

培養(yǎng)基中碳源、氮源以及無(wú)機(jī)鹽等對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響不同。菌體生長(zhǎng)依賴于合適的碳源和氮源，Abdullah等[52]在優(yōu)化黑曲霉ABT-5產(chǎn)果膠酶培養(yǎng)條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)果糖和尿素作為碳源時(shí)可獲得最大果膠酶活力。Amin等[53]研究發(fā)現(xiàn)在固態(tài)發(fā)酵工藝下，當(dāng)初始pH 3.0、35 ℃、含有甘氨酸、果膠和MnSO4存在時(shí)，Penicilliumnotatum產(chǎn)多聚半乳糖醛酸酶活性較高，而在初始pH 5.0、30 ℃、濕度50%、含有CaCO3、(NH4)2SO4、乳糖作為營(yíng)養(yǎng)源時(shí)，Coriolusversicolor產(chǎn)多聚半乳糖醛酸酶活性較高。Chen等[54]以中藥皂甙提取物為底物，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶和果膠酶，初步優(yōu)化后果膠酶活力達(dá)到227 U/mL，而當(dāng)在提取物中加入5%葡萄糖發(fā)酵后，果膠酶活力可達(dá)到1 390 U/mL。以上研究表明，在遵循微生物基本生長(zhǎng)特性情況下，嘗試采用不同的營(yíng)養(yǎng)成分以及進(jìn)行合理組合對(duì)提高果膠酶產(chǎn)量起到積極的作用。

3.2 發(fā)酵條件和方式

表2展示了近年來(lái)有關(guān)微生物果膠酶發(fā)酵條件研究的報(bào)道。有關(guān)微生物果膠酶發(fā)酵條件優(yōu)化方法也是以響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)居多[55-58]。例如，Mahesh等[57]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了Aspergillusibericus果膠酶發(fā)酵條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH 4.0、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時(shí)間120 h，以2%果膠為底物的情況下，該菌株所產(chǎn)果膠酶活力達(dá)到69.6 U/mL。Bibi等[59]通過(guò)中心組合試驗(yàn)優(yōu)化Bacilluslicheniformis果膠酶發(fā)酵條件，確立了pH、溫度、接種量等參數(shù)，在最優(yōu)條件下該菌所產(chǎn)果膠酶活力達(dá)到219 U/mL。Ortiz等[60]研究了AspergillusgiganteusRRL10產(chǎn)果膠酶的固態(tài)發(fā)酵工藝，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出RRL10產(chǎn)酶條件，確定了pH、溫度和CaCl2是影響產(chǎn)酶的重要因素。此外，Kaur等[61]優(yōu)化了BacillussubtilisSAV-21固態(tài)發(fā)酵條件，發(fā)現(xiàn)在溫度35 ℃，濕度60%、pH 4.0，發(fā)酵96 h時(shí)果膠酶活力最高。

表2 不同菌株的果膠酶發(fā)酵條件及產(chǎn)量?

相比于培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對(duì)果膠酶菌株產(chǎn)酶影響，細(xì)胞固定化也是影響菌株產(chǎn)酶的一個(gè)因素[66-67]。例如，Ejaz等[67]研究了固定化GeotrichumcandidumAA15細(xì)胞產(chǎn)果膠酶的參數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化GeotrichumcandidumAA15果膠酶酶活性為0.554 IU/mL，遠(yuǎn)高于游離細(xì)胞0.215 IU/mL的酶活。之后，Ahmed等[66]對(duì)比了GeotrichumcandidumAA15細(xì)胞在游離狀態(tài)下和固定化狀態(tài)下對(duì)產(chǎn)果膠酶的影響，同樣發(fā)現(xiàn)經(jīng)玉米芯固定化的GeotrichumcandidumAA15表現(xiàn)出更高的酶活性，且不表現(xiàn)出分解代謝物阻遏作用。

4 微生物果膠酶的生化性質(zhì)

從報(bào)道的果膠酶分子量來(lái)看，多數(shù)微生物果膠酶的分子在30.0～70.0 kDa，如Kumar等[68]報(bào)道的芽孢桿菌和放線菌果膠酶的分子量分別是34.9，45.1 kDa。不同菌株之間果膠酶分子量差別較大，即使同一種果膠酶，分子量也有差異。Barma等[69]報(bào)道的黑曲霉果膠酶分子量在34.0～42.0 kDa，而Anand等[70]報(bào)道的黑曲霉MTCC478所產(chǎn)的外切聚半乳糖醛酸酶分子量為124.0 kDa。一般細(xì)菌果膠酶最適溫度相對(duì)于真菌果膠酶而言相對(duì)較高，能夠達(dá)到50～60 ℃，但是也要注意有些真菌外切聚半乳糖醛酸酶最適溫度能夠達(dá)到60～65 ℃[71-72]，Tounsi等[73]報(bào)道的Penicilliumoccitanis聚半乳糖醛酸酶最適溫度甚至高達(dá)70 ℃。對(duì)于最適pH研究，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)菌果膠酶主要集中在pH 7.5～10.0，而真菌果膠酶最適pH主要集中在pH 4.0～7.0，當(dāng)然也有部分堿性果膠酶菌株存在。通過(guò)對(duì)比可以看出，微生物果膠酶可能具備在各種復(fù)雜環(huán)境條件下降解基質(zhì)的特性，并具有較為廣泛的適應(yīng)性。針對(duì)微生物果膠酶pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性等研究，可以發(fā)現(xiàn)一些真菌果膠酶通常都具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，Bennamoun等[7]發(fā)現(xiàn)Aureobasidiumpullulans在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，其所產(chǎn)果膠酶在5～90 ℃、pH 5.0～10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適溫度和pH分別為60 ℃和5.0。Ma等[74]報(bào)道的黑曲霉SW06外切聚半乳糖醛酸酶在pH 3.0～5.0、溫度60 ℃以下穩(wěn)定。另外研究人員[64,75]發(fā)現(xiàn)不同金屬離子對(duì)果膠酶活性影響顯著，其中Fe3+、Ba2+、Ca2+、Cu2+等對(duì)酶活力有提高作用，而Mn2+、Ag+對(duì)酶活力有抑制作用。不過(guò)在已有研究[76]中發(fā)現(xiàn)Ca2+也能夠抑制外切聚半乳糖醛酸酶活性。因此對(duì)于金屬離子對(duì)酶活性的影響，也要因菌株差異而加以確定。

此外，Bekli等[77]比較了源于解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensS6果膠酸裂解酶和重組果膠酸裂解酶(PelS6)的生化性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PelS6與枯草芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens168果膠酸裂解酶的氨基酸序列同源性為100%。雖然這兩者在基因序列上非常接近，但在生化性質(zhì)上卻差異顯著，相比較Bacillusamyloliquefaciens168的酶活力(12.8±0.3) U/mg，重組酶活力更高，達(dá)到(49.6±0.4) U/mg。

5 果膠酶的固定化研究

酶固定化研究已形成了相對(duì)完善的技術(shù)體系，包括固定酶的載體材料體系和無(wú)載體固定化體系。目前果膠酶固定化以及應(yīng)用已有諸多研究報(bào)道[78-79]，主要從固定化載體、固定化條件對(duì)酶活性影響等方面進(jìn)行介紹。

用于固定化的載體材料有很多種，如無(wú)機(jī)載體、磁性納米材料、天然高分子和合成高分子載體等。其中磁性納米材料以其可控的尺寸、比表面積大以及良好的生物相容性等特性廣泛應(yīng)用于果膠酶的固定化研究中[80-81]。例如，F(xiàn)ang等[82]開(kāi)展了磁性復(fù)合材料Fe3O4@SiO2-NH2固定果膠酶的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化果膠酶在循環(huán)利用7次后仍保持64.4%的酶活性，且貯藏30 d后還能保持21.1%的酶活性。同樣Dal-Magro等[83]報(bào)道磁性殼聚糖固定果膠酶的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在橙汁澄清處理工藝中，固定化的果膠酶循環(huán)使用25次后，仍然能保持85%的酶活性，這與de Oliveira等[84]報(bào)道海藻酸鈉固定化Aspergillusaculeatus果膠酶處理蘋(píng)果汁所起的作用相似。從這些研究中可以看出，利用這些磁性復(fù)合材料的應(yīng)用極大地提高了果膠酶的重復(fù)利用率。

由于固定化酶的活性受載體類(lèi)型、粒徑、交聯(lián)劑、緩沖體系以及超聲波等諸多因素影響[85-86]，因此在果膠酶固定化研究過(guò)程中也應(yīng)重視。例如，Alag?z等[87]發(fā)現(xiàn)分別使用戊二醛和3-GPTMS將果膠酶固定在弗羅里硅土和納米二氧化硅上，用3-GPTMS參與固定的果膠酶完全失去了活性，而用戊二醛固定在弗羅里硅土和納米二氧化硅上的果膠酶分別保留了10%和75%的酶活性，而且納米二氧化硅固定化的果膠酶催化效率比固定在弗羅里硅土的果膠酶高6.3倍。Rehman等[88]研究了瓊脂包埋法固定化果膠酶的條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)瓊脂用量增加到3%時(shí)，固定化的果膠酶活力達(dá)到最高。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)與游離酶相比，固定化的果膠酶最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH均發(fā)生了變化，分別由原來(lái)的45 ℃變?yōu)?0 ℃，pH由10.0變?yōu)?.0。最適反應(yīng)溫度變化可能與固定化果膠酶反應(yīng)需要更多的活化能有關(guān)，而最適pH發(fā)生改變則與在包埋微環(huán)境下果膠酶結(jié)構(gòu)和構(gòu)象穩(wěn)定性有關(guān)。Mahesh等[57]采用納米多孔活性炭固定化Aspergillusibericus果膠酶，同樣發(fā)現(xiàn)與游離酶相比，固定化果膠酶熱穩(wěn)定得到提高。此外，Mahmoud等[89]比較了綠色木霉Trichodermaviride果膠酶在游離態(tài)、海藻酸鈉微膠囊以及海藻酸鈉納米膠囊固定化條件下性質(zhì)變化。其中納米膠囊固定化果膠酶最適pH與游離酶相比，由原來(lái)的pH 6.0變?yōu)?.5，這與Rehman等[88]研究結(jié)果相似，同時(shí)經(jīng)過(guò)固定化的果膠酶，pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性也會(huì)發(fā)生變化，固定化的果膠酶對(duì)酸和溫度的耐受性進(jìn)一步提高。

6 展望

果膠酶因其良好的生物催化功能而廣泛應(yīng)用于各類(lèi)工業(yè)催化過(guò)程中。隨著對(duì)微生物果膠酶的深入研究和應(yīng)用實(shí)踐，人們期望獲得純度更高、價(jià)格更為低廉的果膠酶。與此同時(shí)，中國(guó)學(xué)術(shù)界及產(chǎn)業(yè)界在果膠酶菌種篩選、誘變育種、工程菌構(gòu)建、發(fā)酵工藝優(yōu)化以及酶的固定化等方面進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究和探索，使得具有各種特性的微生物果膠酶進(jìn)一步應(yīng)用成為可能。

結(jié)合中國(guó)微生物果膠酶研究現(xiàn)狀，筆者認(rèn)為今后在以下幾個(gè)方面仍需要加強(qiáng)科學(xué)研究：① 如何開(kāi)發(fā)熱穩(wěn)定性更高的耐高溫果膠酶以及能夠更好適應(yīng)酸性或堿性環(huán)境下的果膠酶；② 如何構(gòu)建過(guò)量表達(dá)的優(yōu)良工程菌株；③ 如何開(kāi)發(fā)先進(jìn)的發(fā)酵工藝，有效提高生產(chǎn)效率及降低成本；④ 加強(qiáng)果膠酶固定化研究開(kāi)發(fā)工作，進(jìn)一步提高酶的穩(wěn)定性以及重復(fù)利用率。另外從果膠酶的分子進(jìn)化研究來(lái)看，依賴于生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)工程及分子生物學(xué)技術(shù)等，也有望獲得具有全新特性的果膠酶并應(yīng)用于新的領(lǐng)域，這也將是微生物果膠酶研究的一個(gè)重要方向?？偟膩?lái)說(shuō)，篩選性能更好的果膠酶產(chǎn)生菌、加強(qiáng)優(yōu)良菌種選育以及上下游發(fā)酵工藝的優(yōu)化是個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程。