陳簡一

(安徽省合肥市第八中學(xué))

1 引言

1928年，印度科學(xué)家Raman發(fā)現(xiàn)了拉曼散射現(xiàn)象，兩年后被授予諾貝爾物理學(xué)獎。1974年，F(xiàn)leischmann等人在溶液中觀察到吡啶分子吸附在粗糙的銀電極表面上顯著增強的拉曼散射[1]。與正常拉曼信號相比，吸附分子的拉曼散射信號的增強因子要高出106倍。這就是著名的表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)技術(shù)。自從SERS效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)以來，由于其具有快速、超靈敏、指紋識別、無損等優(yōu)勢，已經(jīng)在材料科學(xué)、生物化學(xué)與成像、催化反應(yīng)和電化學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

肉類與普通百姓生活休戚相關(guān)，肉類的種類和品質(zhì)是關(guān)乎百姓的身體健康的重要問題。而針對肉類物質(zhì)的現(xiàn)場、原位、快速、準(zhǔn)確、低廉的檢測方法目前還沒有。

中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院納米材料與環(huán)境檢測實驗室，在毒品、爆炸物和有機污染物的SERS檢測方面開展看大量研究，取得了豐碩的成果[2-7]。本研究論文是作者利用寒暑假和節(jié)假日跟隨家人“泡”在實驗室，并開展研究性學(xué)習(xí)的一個具體案例。設(shè)計并合成SERS增強基底，利用便攜式拉曼光譜儀，結(jié)合軟件和智能算法，實現(xiàn)對不同種類的肉類快速準(zhǔn)確智能識別。本研究的優(yōu)勢在于：(1)操作簡單，取樣量少：將制備好的小指甲蓋大小的硅片基底與待測肉類接觸擦拭一下即可；(2)快速簡便：便攜式儀器便于現(xiàn)場操作，并在5秒內(nèi)給出判定結(jié)果；(3)成本低：一次檢測成本在一毛錢左右；(4)智能：利用識別軟件和數(shù)據(jù)庫比對，直接給出肉的種類。下面是具體的研究內(nèi)容。

2 實驗部分

2.1 主要儀器

FEI Sirion-200場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)，島津SHIMADZU-UV-2550型紫外-可見(UV-vis)分光光譜，LabRAM HR800共聚焦拉曼光譜儀，DeltaNu Inspector 便攜拉曼光譜儀。

2. 2 試劑

HAuCl4(1%)、1%的檸檬酸鈉、超純水。

2.3 金納米顆粒的制備

(1)實驗裝置包括三口燒瓶、冷凝管、油浴皿。原料從三口燒瓶的兩側(cè)加入，采用加熱比較均勻油浴作為加熱源，有利于合成單分散性較好的納米顆粒。冷凝水循環(huán)水是下進上出，提高熱交換的效率。(2)在三口燒瓶中加入99 mL的水，再加入1 mL的1%的HAuCl4,攪拌加熱至沸騰；(3)立即加入2 mL的1%的檸檬酸鈉，可以觀察到溶液由淺黃色-紫色-紅色-酒紅色，繼續(xù)加熱30 min；(4)停止攪拌、加熱及冷凝水，實驗結(jié)束，冷卻至室溫；(5)將上述100 mL的溶膠離心濃縮至1 mL，待用。

2.4 SERS基底的制備

2.5 待測樣品的制備

將上述SERS基底與待測肉類樣品表面接觸并擦拭一下即可。

2.6 SERS樣品的檢測

將上述制備好的樣品，放在便攜式拉曼光譜儀激光探頭下進行檢測。激發(fā)波長785納米，收集時間3秒。

2.7 模型訓(xùn)練和數(shù)據(jù)庫的建立

所獲取的肉類SERS譜圖采用化學(xué)計量學(xué)中的主成分分析(PCA)與支持向量機(SVM)來構(gòu)建自動辨識模型，并建立不同種類肉品的樣品數(shù)據(jù)庫，對未知樣本進行預(yù)測和識別。

3 結(jié)果與討論

3.1 金納米顆粒的性能表征

圖1a所示為金納米溶膠的紫外-可見吸收光譜圖，其吸收峰的位置在534nm處，從圖中可以看出峰形狀相對對稱，半高寬較窄，因此初步判斷單分散性較好。取1 mL的Au溶膠在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心去除上清液后搖勻，然后滴加在硅片上，干燥后即為SERS基底。圖1b是其掃描電子顯微鏡(SEM)照片，從圖中可以看到其整體的單分散性較好，這與之前的UV-Vis結(jié)果相對應(yīng)，這些粒子的尺寸大概為55 nm，理論顯示該尺寸大小的納米顆粒SERS增強效果較好。

圖1 (a)金溶膠的紫外-可見吸收光譜；(b)金納米顆粒的掃描電子顯微鏡圖

3.2 四種肉類的SERS譜圖分析

表面增強拉曼光譜因其能夠提供分子的指紋信息、高靈敏度檢測手段而廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、環(huán)境等領(lǐng)域中。這里主要采用SERS技術(shù)來測量四種常見的肉類，從而確定其種類，甄別出不法商販掛羊頭賣狗肉之嫌。將制備好的SERS基底硅片分別與雞肉、牛肉、羊肉、豬肉接觸刮擦之后，分別進行拉曼光譜采集。如下圖a1、b1、c1、d1分別給出浸沾有雞肉、牛肉、羊肉和豬肉血水的SERS光譜圖。根據(jù)譜圖解析，雞肉、牛肉、羊肉、豬肉，SERS光譜的主要信號來自于次黃嘌呤[11]，其特征峰的具體歸屬如表一所示?？梢钥闯鲋饕奶卣鞣逦恢孟嗨?，峰強度之比差別不大，這就給肉類的判別增加了難度。a2、b2、c2、d2分別為雞肉、牛肉、羊肉和豬肉血水的20條SERS光譜圖，其標(biāo)準(zhǔn)變差RSD分別為11.2%，13.5%，14.3%，9.7%，均小于20%，因此每種肉類譜峰的重復(fù)性和穩(wěn)定性都特別好。又由于不同種類肉的SERS譜圖差別不大，這為一步證實了直接給出肉的種類有很大的難度。因此需要借助其他識別技術(shù)進行識別。

表1 四種肉類樣品的SERS譜峰的歸屬[11]

圖2 a1、b1、c1、d1分別為雞肉、牛肉、羊肉和豬肉血水的SERS光譜圖。a2、b2、c2、d2分別為雞肉、牛肉、羊肉和豬肉血水的20條SERS光譜圖

3.3 四種肉類的智能算法分類

由上述結(jié)果可知，SERS光譜數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性好，但差別小，需要時間和專業(yè)人士去分析而獲取有效的信息。在現(xiàn)場檢測中，我們想要得到的是直觀性的結(jié)果，即肉的種類?？紤]到數(shù)據(jù)處理，我們引進了智能算法化學(xué)計量學(xué)中的主成分分析(principal component analysis, PCA)和支持向量機(support vector machine, SVM)技術(shù)。PCA是一種簡化數(shù)據(jù)集的技術(shù)。它是一個線性變換。這個變換把數(shù)據(jù)變換到一個新的坐標(biāo)系統(tǒng)中，使得任何數(shù)據(jù)投影的第一大方差在第一個坐標(biāo)(稱為第一主成分)上，第二大方差在第二個坐標(biāo)(第二主成分)上，依次類推。主成分分析經(jīng)常用減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時保持?jǐn)?shù)據(jù)集的對方差貢獻最大的特征。這是通過保留低階主成分，忽略高階主成分做到的。這樣低階成分往往能夠保留住數(shù)據(jù)的最重要方面。而SVM是一種基于統(tǒng)計學(xué)習(xí)理論的機器學(xué)習(xí)方法，針對小樣本情況表現(xiàn)出的優(yōu)良性能，目前被廣泛應(yīng)用于函數(shù)回歸、模式識別和故障診斷等方面。支持向量機采用的是結(jié)構(gòu)風(fēng)險最小化準(zhǔn)則訓(xùn)練學(xué)習(xí)機器，其建立在嚴(yán)格的理論基礎(chǔ)之上，很好地解決了高維度數(shù)、非線性、局部極小點等問題。

在本研究中，采用PCA和SVM來構(gòu)建自動辨識模型，并對未知樣本進行預(yù)測。首先對光譜數(shù)據(jù)進行基線扣除，采用的方法是多項式擬合去除基線漂移；接著對扣除基線的光譜采用PCA進行光譜的主體成分獲取(以累計貢獻率為99%)；然后獲得主成分?jǐn)?shù)據(jù)經(jīng)過歸一化(將數(shù)據(jù)數(shù)值控制在0～1之間，此為后續(xù)SVM處理的必要步驟)后，抽取部分?jǐn)?shù)據(jù)(全部數(shù)據(jù)的2/3)建立智能辨識(分類)模型，利用剩余數(shù)據(jù)對已構(gòu)建模型進行測試。圖3是四種肉類SERS譜圖經(jīng)PCA處理之后，前三主成分的得分圖，由圖可知，不同肉類的得分散點圖在空間上的分布位置不同且重疊部分較少，而同一種肉類的空間分布趨于統(tǒng)一。因此，后續(xù)算法(SVM)可以很容易基于經(jīng)PCA處理后的光譜數(shù)據(jù)對上述四種肉類進行區(qū)分，進而達到準(zhǔn)確辨識的目的。

圖3 雞肉、牛肉、羊肉和豬肉SERS光譜經(jīng)PCA處理后前三主成分的得分分布散點圖；Pc1，Pc2和Pc3為前三主成分向量；a,b為不同角度呈現(xiàn)的同一得分散點圖

實驗環(huán)境使用的是C++，2G內(nèi)存，Windows 7操作系統(tǒng)，語言使用的是Matlab 8.0。所建立的模型對未知樣本進行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果如圖4所示，預(yù)測總體準(zhǔn)確率為89%，對雞肉、牛肉、羊肉及豬肉預(yù)測準(zhǔn)確率分別為100%，90%，86%和80%，基本上達到實際應(yīng)用要求。由此可以看我們得到的數(shù)據(jù)模型的準(zhǔn)確率是非常高的。之所以能夠達到這樣高的準(zhǔn)確率，是因為數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)之間的特異性。也就說，在便攜拉曼儀上運用SERS和SVM可以實現(xiàn)對肉類樣品的現(xiàn)場快速檢測判斷。

圖4 模型預(yù)測結(jié)果。其中測試樣本是指未參與模型訓(xùn)練的樣本；訓(xùn)練樣本是指參與過模型訓(xùn)練的樣本

4 結(jié)論

利用檸檬酸鈉還原合成了55 nm大小單分散性較好的金納米顆粒，離心濃縮滴加在硅片上成膜，構(gòu)建出SERS增強基底。分析雞肉、牛肉、羊肉和豬肉SERS譜圖，得出每種肉類的譜峰重復(fù)性和穩(wěn)定性好，不同種類肉的SERS譜圖差別不大。采用PCA和SVM來構(gòu)建自動辨識模型，并對未知樣本進行預(yù)測。結(jié)果顯示，預(yù)測總體準(zhǔn)確率為89%，對雞肉、牛肉、羊肉和豬肉四種肉預(yù)測準(zhǔn)確率分別為100%，90%，86%和80%，達到實際應(yīng)用要求。通過設(shè)置軟件中結(jié)果的顯示方式，可以快速得到直觀的判斷結(jié)果。這就更方便了執(zhí)法人員在現(xiàn)場中的使用，也使得SERS技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合現(xiàn)場的實用化技術(shù)。

致謝：感謝中科院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院納米材料與環(huán)境檢測實驗室提供的試驗平臺；感謝晏秀男姐姐(碩士生)指導(dǎo)合成金納米顆粒和制備SERS基底，感謝葛美紅姐姐(碩士生)一起采集拉曼光譜，感謝周彬斌哥哥(博士生)的SERS光譜解析，感謝翁士狀哥哥(博士)在智能算法方面的指導(dǎo)和結(jié)果分析；感謝合肥市淠河路美華農(nóng)家樂飯店提供的肉類樣品。感謝楊良保研究員給予實驗設(shè)計和方法指導(dǎo)。