恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的代謝及代謝關(guān)鍵酶

劉婉玉，Tadiyose Girma Bekele，趙洪霞

大連理工大學環(huán)境學院，工業(yè)生態(tài)和環(huán)境工程教育部重點實驗室，大連 116024

恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)是第三代人工合成的氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物，具有抗菌譜廣、殺菌性強的特點而被大量應用于人類和獸類疾病的預防與治療[1]。在實際生產(chǎn)中，不遵守休藥期的藥物濫用情況十分嚴重[2-3]。這不僅會給動物機體造成傷害，更會隨著食物鏈的傳遞危害人類健康。恩諾沙星進入生物體內(nèi)后，會在生物體藥物代謝酶的作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，可能會產(chǎn)生毒性更強的代謝產(chǎn)物，從而影響其生態(tài)毒性。細胞色素P450酶(CYP450)又被稱為多功能氧化酶，是一類廣泛分布于生物體內(nèi)的藥物代謝酶，能夠參與外源性物質(zhì)如抗生素、農(nóng)藥和麻醉劑等的生物轉(zhuǎn)化，在污染物的生物轉(zhuǎn)化過程中起著十分關(guān)鍵的作用[4]。目前，關(guān)于恩諾沙星的生物代謝研究大多是關(guān)于其在生物體內(nèi)的消除規(guī)律及其在不同組織中的代謝產(chǎn)物識別[5-8]，對于其在水生生物體CYP450作用下的代謝轉(zhuǎn)化機制尚不清楚，恩諾沙星代謝的關(guān)鍵酶還未確定，因此，有必要對其在水生生物體CYP450酶作用下的代謝轉(zhuǎn)化進行深入研究。本研究采用鯽魚肝微粒體體外孵育法，探究恩諾沙星在CYP450酶的作用下的代謝轉(zhuǎn)化過程及參與其代謝的關(guān)鍵酶，以期為評價其生態(tài)和健康風險提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

實驗動物為鯽魚，購于大連市中山公園花鳥魚蟲市場，個體質(zhì)量為240～300 g。實驗前將其暫養(yǎng)10 d，養(yǎng)殖水為自來水，使用前連續(xù)曝氣24 h，水溫為(28 ± 1) ℃。

1.2 主要試劑

恩諾沙星及環(huán)丙沙星標準品(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；乙腈、甲醇、二氯甲烷、酮康唑、雙硫侖和二甲基亞砜(色譜純，美國Sigma公司)；還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、三羥甲基氨基甲烷和甘氨酸(分析純，北京索萊寶科技有限公司)；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀和氯化鈣(分析純，天津市大茂化學試劑廠)；乙二胺四乙酸二鈉(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)。

1.3 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀(美國Agilent公司，Agilent 1100)；高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司，Xevo TQ-S)；熒光分光光度計(日本Hitachi公司，F(xiàn)4500)；冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，H1750R)；紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司，UV 6100)；手持式勻漿機(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，F(xiàn)6/10)；全溫振蕩培養(yǎng)箱(天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司，ZQPW-70)。

1.4 緩沖溶液配制

0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS)：稱取11.18 g KCl、80 g NaCl、32.3 g Na2HPO4·12H2O、4.5 g NaH2PO4·2H2O和0.029 g 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，用超純水溶解，濃HCl調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至1 L。

勻漿緩沖液為含10%(V∶V)甘油的0.1 mol·L-1PBS緩沖溶液。保存緩沖液為含20%(V∶V)甘油的0.1 mol·L-1PBS緩沖溶液。0.1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液：稱取12.11 g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，用超純水溶解，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至1 L。

1.5 肝微粒體制備

鯽魚肝微粒體制備參照沈夢楠[9]的方法。取健康的鯽魚，置于冰上解剖得到鯽魚的肝臟組織，用5 mL預冷的緩沖溶液反復沖洗3次，洗去血紅蛋白，用濾紙擦去多余的液體，稱重。組織剪碎后按1∶4 (m∶V)加入預冷的勻漿緩沖液，用內(nèi)切式組織勻漿機于冰浴中制成勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)入預冷離心管中，4 ℃、10 000 g離心30 min，小心取出全部上清液，按10∶1(V∶V)加入88 mmol·L-1的CaCl2溶液，混勻后，于4 ℃、15 000 g離心60 min。棄上清，沉淀即為微粒體組分。將微粒體沉淀取出后加入少許保存緩沖液，保持冰浴環(huán)境渦旋振蕩1 min，進行2次，充分混勻，分裝于凍存管中，置-80 ℃保存，以備檢測用。

1.6 體外孵育實驗

恩諾沙星暴露濃度、微粒體蛋白含量和反應溫度的設(shè)置參照文獻[10]。樣品組設(shè)置3個濃度組，恩諾沙星終濃度分別為1、5和10 mg·L-1。樣品體系主要包含0.1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)，1 mmol·L-1NADPH、10 mg微粒體蛋白和恩諾沙星(1、5或10 mg·L-1)，反應體系總體積為1 mL。除樣品組外還設(shè)置空白對照組，即不含目標化合物組，在體外孵育體系中加入100 μL超純水代替恩諾沙星。反應體系于28 ℃預孵5 min后，加入NADPH以啟動反應，反應溫度為28 ℃，分別孵育0、5、15、45和90 min，加入2 mL預冷的二氯甲烷終止反應。所有樣品均設(shè)置3組平行。

1.7 代謝抑制實驗

代謝抑制實驗中，選擇雙硫侖和酮康唑作為抑制劑。樣品組抑制劑設(shè)置2個濃度組，分別為5 μmol·L-1和50 μmol·L-1。樣品體系主要包含0.1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4)、1 mmol·L-1NADPH、10 mg微粒體蛋白、恩諾沙星(1、5或10 mg·L-1)和抑制劑(5 μmol·L-1或50 μmol·L-1)，反應體系總體積為1 mL。對照組不含抑制劑，在體外孵育體系中加入25 μL 二甲基亞砜(DMSO)代替抑制劑。代謝抑制實驗中，首先在反應體系中加入25 μL抑制劑和NADPH，28 ℃預孵5 min后加入恩諾沙星，反應體系28 ℃孵育90 min后，加入2 mL預冷的二氯甲烷終止反應。所有樣品均設(shè)置3組平行。

1.8 樣品前處理

將終止反應的體外孵育樣品置于渦旋混合器振蕩混合1 min，于4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min，取二氯甲烷有機相，移入氮吹管中，剩余殘渣加入1 mL的二氯甲烷，再次渦旋混合后離心。重復2次后，合并有機相，在40 ℃氮氣流下吹干，以1 mL超純水定容，過0. 22 μm濾膜后，檢測分析。

1.9 酶活性測定方法

1.9.1 苯胺4-羥化酶(AH)活性測定

AH活性測定參照Burkina等[11]的方法。4-氨基酚標準曲線制備：分別取10 μmol·L-14-氨基酚0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8和1. 0 mL，用質(zhì)量分數(shù)為6%的三氯醋酸(TCA)補足至1.0 mL，加入體積分數(shù)為1%的苯酚1 mL，混勻后再加入1 mol·L-1的Na2CO3溶液1 mL，充分混勻后，放置30 min，空白調(diào)零，于630 nm處測定各管的吸光度值，繪制4-氨基酚標準曲線。AH活性測定：取10 mmol·L-1NADPH溶液0.1 mL和10 mmol·L-1鹽酸苯胺溶液0.5 mL，置于試管中，混勻，對照管加0.5 mL超純水代替苯胺，28 ℃孵育2 min。各管均加0.5 mL微粒體懸液，28 ℃再孵育30 min，加1 mL冰冷的質(zhì)量分數(shù)為20%的TCA終止反應。冰浴5 min，11 000 r·min-1離心，取上清液1 mL于另一試管中，加體積分數(shù)為1%的苯酚1 mL，混勻，再加入1 mol·L-1的Na2CO31.0 mL，充分混勻后，放置30 min，空白調(diào)零，于630 nm處測定各管的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算4-氨基酚濃度，以nmol(4-氨基酚)·min-1·mg-1表示其酶活性。

1.9.2 7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)活性測定

ECOD活性測定參照李陽等[12]的方法。7-羥基香豆素標準曲線制備：分別取1.62 mg·L-1的7-羥基香豆素溶液0、0.25、0.5、1、1.5和2.0 mL，用Tris-HCl溶液補足到5.0 mL，混勻后于390 nm激發(fā)波長和440 nm發(fā)射波長下測定上述各濃度7-羥基香豆素對應的熒光強度，繪制7-羥基香豆素標準曲線。ECOD活性測定：取0.5 mL微粒體蛋白懸液，加入20 μL的底物7-乙氧基香豆素(終濃度為1.0 mmol·L-1)，混勻后以0.1 mol·L-1、pH 7.4的Tris-HCl緩沖液補充到1 mL，28 ℃孵育2 min后，測定管加入10 mmol·L-1NADPH 0.1 mL，空白管加入超純水0.1 mL。28 ℃孵育20 min后迅速取出并置于冰上，加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的TCA終止反應。反應完畢后，將反應混合液于4 ℃、10 000 r·min-1下離心5 min，取上清，加入2 mL 甘氨酸-氫氧化鈉(Gly-NaOH)溶液(0.6 mol·L-1，pH 10.5)，震蕩混勻后，在激發(fā)波長為335 nm、發(fā)射波長為455 nm下測定產(chǎn)物的熒光值，根據(jù)標準曲線計算7-羥基香豆素濃度，以nmol(7-羥基香豆素) ·min-1·mg-1表示其酶活性。

1.10 檢測條件

1.10.1 HPLC檢測條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，流動相為體積分數(shù)為0.1%的甲酸水溶液和乙腈(V∶V=7∶3)，流速為0.4 mL·min-1，進樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為283 nm。

1.10.2 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測條件

色譜柱為Waters Symmetry C8 (50 mm×2.l mm，5 μm)，柱溫為25 ℃，流速為0.3 mL·min-1，進樣量為10 μL，流動相A為0.005 mol·L-1醋酸銨溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH至2.5)，B為乙腈，梯度洗脫條件：0～5 min，3%～25% B；5～6 min，25%～35% B；6～7 min，35%～55% B；7～8 min，55% B；8～9.5 min，55%～3% B；9.5～12.5 min，3% B。

質(zhì)譜條件：電離模式為ESI+，離子源溫度為150 ℃，多溶劑氣溫度為350 ℃，錐孔電壓為25 V，碰撞能為15 eV，掃描模式為SIR和子離子掃描。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 恩諾沙星體外代謝

2.1.1 恩諾沙星體外代謝動力學

恩諾沙星暴露濃度參照文獻中的濃度設(shè)置[10]，當恩諾沙星體外暴露濃度為1、5和10 mg·L-1時，恩諾沙星體外代謝過程符合一級動力學方程lnCt/C0=-kt，動力學擬合曲線圖1所示。擬合得到恩諾沙星在鯽魚肝微粒中的代謝動力學參數(shù)，包括消除速率常數(shù)(k)、半衰期(t1/2)，如表1所示。當恩諾沙星體外暴露濃度為1、5和10 mg·L-1時，恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的k分別是0.00303、0.00204和0.00266 min-1，半衰期t1/2分別是228.8、339.8和260.6 min，其中當恩諾沙星暴露濃度為1 mg·L-1時，其在肝微粒體中的k最大，為0.00303 min-1，t1/2最短，為228.8 min。本研究中恩諾沙星在1、5和10 mg·L-13個暴露濃度條件下的t1/2均比Shan等[13]的研究中恩諾沙星在鯽魚體內(nèi)t1/2(64.66 h)的值低，這可能是體外代謝實驗中的恩諾沙星能夠與代謝酶直接接觸，避免了體內(nèi)復雜生理因素的干擾，使其代謝轉(zhuǎn)化速率變高，半衰期縮短。

圖1 恩諾沙星代謝動力學擬合曲線Fig. 1 Fitting curve of enrofloxacin metabolic kinetics

2.1.2 恩諾沙星體外代謝產(chǎn)物

恩諾沙星暴露濃度為10 mg·L-1，孵育90 min，采用HPLC-MS/MS技術(shù)，對恩諾沙星及其在鯽魚肝微粒體中的代謝產(chǎn)物進行識別。首先，通過對比空白組與實驗組的色譜圖，共篩選出2種可能存在的代謝產(chǎn)物(M1和M2)，其保留時間等信息如表2所示。然后，根據(jù)其二級質(zhì)譜圖(圖2)的碎片信息，結(jié)合母體化合物的結(jié)構(gòu)，初步推測出產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。

圖2 恩諾沙星代謝產(chǎn)物二級質(zhì)譜圖Fig. 2 MS2 spectra of enrofloxacin metabolite

通過與恩諾沙星標準品的保留時間及碎片離子的比對，可以確定M0為母體化合物恩諾沙星，其保留時間是3.26 min，分子式是[C19H23N3O3F]+，主要碎片離子是342 [MH-F]+、316 [MH-CO2]+和245 [MH-CO2-C2H4NC2H5]+。環(huán)丙沙星是恩諾沙星常見的代謝產(chǎn)物，根據(jù)與環(huán)丙沙星標準品的保留時間及碎片離子的比對，可以確定M1為環(huán)丙沙星，保留時間2.97 min，分子式[C17H19FN3O3]+，主要碎片離子是245 [MH-CO2-C2H4NH]+和231 [MH-CO2-C2H5N2]+。M2的保留時間是3.12 min，準分子離子是372 [C20H26N3O4]+，主要碎片離子是297 [MH-CO2-O-CH3]+、257 [MH-CO2-O-CH3-C3H4]+和241 [MH-CO2-O-C2H5N-C2H4]+，其分子量比母體化合物增加了12 Da，推測是恩諾沙星脫氟后羥基化，再進一步發(fā)生甲基化得到的產(chǎn)物。

表1 恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的代謝動力學參數(shù)Table 1 Metabolic kinetic parameters of enrofloxacin in liver microsomes of crucian carp (Carassius auratus)

表2 恩諾沙星及其在鯽魚肝微粒體中代謝產(chǎn)物的保留時間、分子量和分子式Table 2 Retention time, molecular weight and molecular formula of enrofloxacin and its metabolites in liver microsomes of crucian carp (Carassius auratus)

恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的代謝是在CYP450酶的作用下發(fā)生的。細胞色素P450酶有很多亞型。其中，在CYP3A4亞型作用下，外源污染物能夠發(fā)生脫甲基、脫乙基反應[14]，在CYP2E1亞型作用下外源污染物發(fā)生羥基化反應[15]。因此，推測M1是在CYP3A4作用下的產(chǎn)物，M2是CYP2E1作用下的產(chǎn)物，CYP3A4和CYP2E1是主要參與恩諾沙星體外代謝的P450亞型酶。

2.2 恩諾沙星體外代謝關(guān)鍵酶的確定

為了確定參與恩諾沙星代謝關(guān)鍵酶，首先分析了在體外孵育條件下，恩諾沙星對CYP3A4和CYP2E1亞型酶活性的影響。7-乙氧基香豆素是一種CYP3A4亞型的特異性底物，通過ECOD反映CYP3A4總酶活性，苯胺是CYP2E1亞型的特異性底物，以AH反映CYP2E1總酶活性[16-17]。在不同濃度恩諾沙星體外暴露的條件下，AH和ECOD酶活性隨時間變化趨勢如圖3所示。

圖3 苯胺4-羥化酶和7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶活性隨時間的變化Fig. 3 The change of aniline 4-hydroxylase (AH) and 7-ethoxycoumarin-O-deethylase (ECOD) activities with time

恩諾沙星對AH和ECOD的活性均有一定的抑制作用。AH活性隨時間呈線性下降趨勢。當恩諾沙星濃度增加時，對AH活性抑制作用增強；ECOD活性在0～5 min時，下降趨勢明顯，在5 min后ECOD活性下降趨勢逐漸變緩。為了進一步考察恩諾沙星濃度對AH和ECOD活性的影響，利用SPSS對恩諾沙星濃度和酶活性作相關(guān)性分析。結(jié)果表明，ECOD活性與恩諾沙星濃度顯著性負相關(guān)，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.617；AH活性與恩諾沙星濃度無顯著性相關(guān)關(guān)系(α=0.05)。恩諾沙星對ECOD和AH酶活性有抑制作用。這說明，恩諾沙星具有與CYP3A4和CYP2E1酶結(jié)合的能力，CYP3A4和CYP2E1參與了恩諾沙星的代謝。

代謝抑制實驗中，加入特異性抑制劑與恩諾沙星共同孵育，根據(jù)實驗結(jié)果可初步判斷參與恩諾沙星代謝的CYP450酶亞型。選擇酮康唑(KTZ)和雙硫侖(DIS)分別作為CYP3A4和CYP2E1的抑制劑，抑制劑濃度為5 μmol·L-1和50 μmol·L-1，這2個濃度的選擇參考了文獻[18-19]，這是能夠有效抑制相應CYP450亞型活性的濃度。加入不同濃度的KTZ和DIS后，恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的代謝轉(zhuǎn)化率有不同程度的降低，其抑制情況如圖4所示。

如圖4所示，當恩諾沙星暴露濃度為1、5和10 mg·L-1時，5 μmol·L-1的KTZ和DIS對恩諾沙星代謝均有較弱的抑制作用。KTZ和DIS的濃度增加至50 μmol·L-1時，KTZ對恩諾沙星代謝的抑制率明顯增加，抑制率最高可達80%，而DIS的濃度改變對恩諾沙星代謝抑制率影響較小。因此，與CYP2E1亞型相比，CYP3A4在恩諾沙星代謝過程中作用更大，CYP3A4亞型是恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中代謝的關(guān)鍵亞型酶。

圖4 雙硫侖(DIS)和酮康唑(KTZ)對恩諾沙星體外代謝的影響Fig. 4 Effects of disulfiram (DIS) and ketoconazole (KTZ) on the in vitro metabolism of enrofloxacin

綜上所述，恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的代謝符合一級動力學方程，體外代謝過程中恩諾沙星對CYP3A4和CYP2E1亞型酶活性有一定的抑制作用，CYP3A4亞型酶活性與恩諾沙星呈顯著性負相關(guān)關(guān)系，CYP3A4是參與恩諾沙星代謝的關(guān)鍵亞型酶。本研究結(jié)果為探究恩諾沙星在水生生物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化路徑及其生態(tài)風險提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。