陳穎穎 杜夢夢 李冬霞 羅莎 周同亮 陶慶文

【摘 要】目的：采用不同濃度腺嘌呤進(jìn)行腎虛骨關(guān)節(jié)炎復(fù)合模型建模，建模成功后對其進(jìn)行腎虛與骨關(guān)節(jié)炎各項(xiàng)指標(biāo)測定，選擇最適腺嘌呤建模濃度。方法：將45只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組，模型對照組，腺嘌呤高（150 mg·kg-1）、中（100 mg·kg-1）、低（50 mg·kg-1）劑量組，每組9只。造模成功后檢測大鼠腎虛以及骨關(guān)節(jié)炎各項(xiàng)指標(biāo)，包括大鼠證候評分、皮質(zhì)酮（CORT）、雌二醇（E2）、睪酮（T）含量，關(guān)節(jié)大體情況，HE染色和Mankin's評分。記錄大鼠死亡率。結(jié)果：腺嘌呤高劑量組大鼠證候評分高于腺嘌呤中劑量組與低劑量組（P < 0.05）。與空白對照組、模型對照組比較，腺嘌呤高、中劑量組E2、E2/T、CORT均增高（P < 0.05），T降低（P < 0.01）。模型對照組和腺嘌呤高、中、低劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)表面不光滑，潮線不完整，軟骨厚薄不均勻。與空白對照組比較，模型對照組，腺嘌呤高、中、低劑量組Mankin's評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。腺嘌呤高劑量組死亡率為44%，其余4組無死亡。結(jié)論：腺嘌呤濃度100 mg·kg-1是最適腎虛骨關(guān)節(jié)炎復(fù)合模型建立濃度。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;腺嘌呤;腎虛;動物模型;濃度

【ABSTRACT】Objective：To establish compound models of osteoarthritis with kidney deficiency by using different concentrations of adenine.After the models are established successfully，the indexes of kidney deficiency and osteoarthritis were measured and the optimal concentration of adenine was selected.Methods：Forty-five SD?rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，groups with high adenine（150 mg·kg-1），medium adenine（100 mg·kg-1），low adenine（50 mg·kg-1），9 rats in each.The indexes of kidney deficiency and osteoarthritis were measured after the models were established successfully，including syndrome score，cortisol（CORT），estradiol（E2），testosterone（T），general situation of joints，HE staining and Mankin's score.The mortality of rats was recorded.Results：The syndrome score of high dose group was higher than that of middle dose group and low dose group（P < 0.05）.Compared with blank control group and model control group，E2，E2/T and CORT of high and medium dose adenine group were higher（P < 0.05），while T was lower（P < 0.01）.In the model control group and high，middle and low dose adenine group，the surface of knee joint was not smooth，the tide line was not complete，and the thickness of cartilage was not uniform.Compared with the blank control group，there was a significant difference in Mankin's score between the model control group and the high，medium and low dose adenine group（P < 0.01）.The mortality rate of the high adenine group was 44%，and there were no death in the other four groups.Conclusion：100 mg·kg-1 is the best concentration for the establishment of the compound model of osteoarthritis with kidney deficiency.

【Keywords】 osteoarthritis;adenine;kidney deficiency;animal model;concentration

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種關(guān)節(jié)退行性病變，好發(fā)于中老年人，隨著人口老齡化的加重，患病人數(shù)也逐年升高[1-3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病以腎虛為本，臨床上使用補(bǔ)腎中藥多收獲良效[4-5]。OA基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)常需制備腎虛OA動物模型。在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤法與Hulth法聯(lián)合制備的腎虛OA模型，腎虛證候較其他方法更明顯，且該方法造模較為簡單，收效顯著;然不足之處是常規(guī)劑量（200 mg·kg-1）的腺嘌呤干預(yù)OA大鼠，死亡率較高，這可能由于OA大鼠前期已經(jīng)過一次手術(shù)損傷，身體較弱所致。因此，使用復(fù)合模型制備腎虛OA模型時，選擇合適的腺嘌呤濃度對模型制備成功尤為重要[6]。本實(shí)驗(yàn)旨在探索最適宜的腺嘌呤濃度，為腎虛OA復(fù)合模型制備提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6周齡SPF級雄性SD大鼠45只，購自中國藥品生物制品檢定所，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2014-001，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所動物飼養(yǎng)室，使用許可證號SYXK（京）2016-0043。

1.2 主要試劑 腺嘌呤（Sigma，WXBC4019V）;大鼠雌二醇（E2）試劑盒（BECKMAN，723550）;大鼠睪酮（T）試劑盒（BECKMAN，723553）;大鼠皮質(zhì)酮（CORT）放射免疫分析試劑盒（中國北京北方科技研究所，20180120）。

1.3 主要儀器 貝克曼庫爾特全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（BECKMAN，UniCelDxI 800）;珀金埃爾默PekinElmer放射免疫分析儀（PekinElmer，2470）;舒式切片機(jī)（櫻花病理儀器株式會社，CRM-44）;組織包埋機(jī)（櫻花病理儀器株式會社，5235）;旋轉(zhuǎn)式組織脫水機(jī)（櫻花病理儀器株式會社，4634）;石蠟溶蠟箱（櫻花病理儀器株式會社，PM-401）;雙人顯微鏡（OLYMPUS，BH-2）。

2 方 法

2.1 動物分組與干預(yù) 將45只6周齡SPF級雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組，模型對照組，腺嘌呤高、中、低劑量組，每組9只?？瞻讓φ战M不進(jìn)行造模處理，其余4組先以Hulth法進(jìn)行OA造模，方法如下：采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛4 mL·kg-1麻醉;手術(shù)前手術(shù)區(qū)剃毛以及消毒，取髕韌帶做橫向切口，切斷髕韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶，取出內(nèi)側(cè)半月板，雙層縫合傷口;術(shù)后青霉素肌注16萬U預(yù)防感染[5]。術(shù)后4 d大鼠可常規(guī)行走，傷口基本愈合，此時腺嘌呤灌胃，腺嘌呤高劑量組予150 mg·kg-1，中劑量組予100 mg·kg-1，低劑量組予50 mg·kg-1，連續(xù)灌胃28 d[7]。

2.2 取 材 大鼠麻醉后行心臟取血，所獲得的全血經(jīng)過離心機(jī)以1700 r·min-1離心10 min，離心半徑20 cm，分離上清備用;取手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行HE染色。

2.3 檢測指標(biāo)及方法 造模成功后，分別檢測腎虛及OA指標(biāo)，包括腎虛證候評分表，E2、T、E2/T及CORT含量[8]，關(guān)節(jié)表面大體形態(tài)，HE染色及Mankin's評分。統(tǒng)計各組死亡率，做可行性分析。其中E2、T委托中日友好醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測，CORT委托北京生命科學(xué)研究所進(jìn)行檢測。

2.3.1 腎虛檢測指標(biāo)及方法 根據(jù)《辨證論治實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》提供的動物辨證方法，對大鼠腎虛證候進(jìn)行評分以利于辨證。檢測腎虛相關(guān)指標(biāo)E2、T、E2/T及CORT含量。腎虛證候評分參照文獻(xiàn)[9]。

2.3.2 OA檢測指標(biāo)及方法 對新鮮組織關(guān)節(jié)行大體觀察，對手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行脫鈣，行HE染色及Mankin's評分[10]。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以表示，采用單因素ANOVA分析;非正態(tài)數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)若方差齊，采用LSD、SNK檢驗(yàn);若方差不齊，兩兩比較采用Tamhane's和Dunnett's檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 腎虛檢測結(jié)果

3.1.1 各組大鼠證候評分比較 空白對照組及模型對照組不滿足腎虛證候標(biāo)準(zhǔn)，腺嘌呤高、中、低劑量組均滿足腎虛證候標(biāo)準(zhǔn)。其中腺嘌呤高劑量組大鼠證候評分高于腺嘌呤中、低劑量組（P < 0.05）。見表1。

3.1.2 各組大鼠E2、T、E2/T及CORT含量比較 與空白對照組比較，腺嘌呤高劑量組E2、E2/T、CORT均增高，T降低（P < 0.01）;腺嘌呤中劑量組E2、CORT增高（P < 0.01），E2/T增高（P < 0.05）;腺嘌呤低劑量組E2增高（P < 0.05）。與模型對照組比較，腺嘌呤高劑量組E2、E2/T、CORT均增高，T降低（P < 0.01）;腺嘌呤中劑量組E2、CORT增高（P < 0.01），E2/T增高（P < 0.05），T降低（P < 0.05）。見表2。

3.2 OA檢測結(jié)果

3.2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)表面大體形態(tài) 空白對照組大鼠膝關(guān)節(jié)表面光滑，顏色亮澤，無潰瘍;模型對照組和腺嘌呤高、中、低劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)表面不光滑，顏色晦暗，有潰瘍。

3.2.2 各組大鼠HE染色結(jié)果 空白對照組可見軟骨表面光滑，潮線完整;模型對照組和腺嘌呤高、中、低劑量組大鼠關(guān)節(jié)表面不光滑，潮線不完整，軟骨厚薄不均勻。見圖1。

3.2.3 各組大鼠Mankin's評分比較 模型對照組和腺嘌呤高、中、低劑量組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;模型對照組，腺嘌呤高、中、低劑量組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

3.3 死亡率 造模結(jié)束后，腺嘌呤高劑量組大鼠死亡4只，死亡大鼠異常消瘦，解剖死亡大鼠可見其腎臟較正常大鼠大，且顏色偏白，兩腎臟包膜下有明顯積液，大鼠可能死于較高劑量的腺嘌呤導(dǎo)致的腎功能衰竭。但由于發(fā)現(xiàn)時大鼠已經(jīng)死亡，不能做相應(yīng)的檢測。腺嘌呤高劑量組死亡率為44%，其余4組均無死亡。

4 討 論

OA是臨床上常見的疾病，腎虛是主要病因[11-12]，因此腎虛OA動物模型的制備是研究臨床問題的基礎(chǔ)。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腎虛造模選擇腺嘌呤最優(yōu)[13-15]，OA造模選擇Hulth法最優(yōu)[16-18]，腎虛OA需要復(fù)合模型，因此需要將兩者復(fù)合進(jìn)行造模。但兩種不同造模方法之間會存在影響，因此復(fù)合模型并不是模型之間簡單的疊加[19-20]。本實(shí)驗(yàn)中，Hulth法為手術(shù)方法，不需每日干預(yù)，所以先進(jìn)行Hulth法造模;腺嘌呤法需每日灌胃，需要待手術(shù)之后進(jìn)行該操作?？紤]到手術(shù)對大鼠的損傷，因此腺嘌呤劑量的選擇不能過大。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，200 mg·kg-1腺嘌呤劑量大鼠死亡率過高，無法完成整個造模，所以本次實(shí)驗(yàn)選擇的劑量為150 mg·kg-1、100 mg·kg-1和50 mg·kg-1。

復(fù)合模型在OA表現(xiàn)方面，通過HE染色及Mankin's評分發(fā)現(xiàn)，模型對照組和腺嘌呤高、中、低劑量組大鼠均呈現(xiàn)OA表現(xiàn)，且4組之間Mankin's評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），表明采用Hulth法進(jìn)行OA造模收效良好。

復(fù)合模型在腎虛表現(xiàn)方面，發(fā)現(xiàn)腺嘌呤150 mg·kg-1干預(yù)大鼠，腎虛證候?qū)W指標(biāo)與理化指標(biāo)較腺嘌呤中、低劑量組好，但150 mg·kg-1干預(yù)大鼠，大鼠死亡率為44%，可行性較弱;腺嘌呤100 mg·kg-1干預(yù)大鼠，腎虛結(jié)果較高劑量組次之，死亡率為零;腺嘌呤50 mg·kg-1干預(yù)大鼠，大鼠腎虛表現(xiàn)較弱，多數(shù)指標(biāo)與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

綜上所述，腺嘌呤中劑量組無論在腎虛方面還是OA方面均表現(xiàn)出良好的模型特征，且死亡率為零，可操作性強(qiáng)。因此，在進(jìn)行腎虛OA模型造模時，可以選擇腺嘌呤100 mg·kg-1劑量進(jìn)行造模干預(yù)。

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收稿日期：2019-09-16;修回日期：2019-10-23