劉嘉慶 龍煥屏 于洋洋 李光

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

肺腺癌通常表現(xiàn)出不同程度的放射抵抗性，導(dǎo)致其放射治療效果欠佳〔1～3〕。如何提高肺腺癌的放射敏感性是目前放療領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題。纖維蛋白原樣蛋白(FGL)1是主要在肝臟中衍生表達(dá)的一類(lèi)生長(zhǎng)因子。研究表明，F(xiàn)GL1在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中表達(dá)上調(diào)，被認(rèn)為具有一定的致癌效應(yīng)〔4〕。FGL1與NSCLC免疫治療的預(yù)后有關(guān)，其表達(dá)水平可預(yù)測(cè)程序性細(xì)胞死亡(PD)-1/配體(L)1抑制劑療效〔4〕。FGL1可影響細(xì)胞周期，而細(xì)胞周期與細(xì)胞內(nèi)在的放射敏感性密切相關(guān)〔5〕。有關(guān)FGL1在肺腺癌中的表達(dá)及作用的研究并不多，F(xiàn)GL1對(duì)放療的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本文擬分析FGL1表達(dá)及其可能對(duì)肺腺癌的放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 A549細(xì)胞購(gòu)自沈陽(yáng)海靈興業(yè)商貿(mào)有限公司；質(zhì)粒購(gòu)自吉?jiǎng)P基因；FGL1引物、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Takara逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司；NEOFECTTMDNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自北京碼因科技有限公司。

1.2人肺腺癌組織樣本的選擇 選取在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科手術(shù)的肺腺癌患者的24例癌和癌旁組織標(biāo)本。男10例，女14例，年齡48～69歲，平均(57.12±3.24)歲。

1.3人肺腺癌細(xì)胞系的培養(yǎng) 配置含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液，將A549細(xì)胞置于含有5% CO2的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4轉(zhuǎn)染 按照說(shuō)明書(shū)要求，利用助轉(zhuǎn)染試劑將FGL1沉默(shRNA#1/#2)及沉默對(duì)照(NC-shRNA)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中。

1.5RT-PCR FGL1正向引物5′-CTTTTGCAGGAGAATGAAGTCC-3′，反向引物5′-CTCTGAACAATCTGCATACTGC-3′；β-actin正向引物5′-CCAGACAGCACTGTGTTGGCATA-3′，反向引物5′-ATGTTGCCCTAGACTTCGAGCAAG-3′。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算倍數(shù)變化。

1.6克隆形成實(shí)驗(yàn) 在6孔板中根據(jù)劑量梯度接種不同數(shù)目的細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后分別給予0，2，4，6，8 Gy的電離輻射；繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色；計(jì)數(shù)克隆，根據(jù)單擊多靶模型繪制劑量-存活曲線(xiàn)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用GraphPad Prism7.00進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1FGL1在肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá)差異 16例肺腺癌組織FGL1含量比癌旁組織高；肺腺癌FGL1含量(11.100±19.333)明顯高于癌旁組織(1.000±0.000，P<0.05)。

2.2A549細(xì)胞中FGL1沉默效果 轉(zhuǎn)染shRNA#1和shRNA#2的A549細(xì)胞中FGL1含量分別為0.524±0.154和0.494±0.072，顯著低于轉(zhuǎn)染NC-shRNA的A549細(xì)胞(1.000±0.000；P<0.01和P<0.001)。

2.3沉默F(xiàn)GL1對(duì)肺腺癌細(xì)胞放射敏感性的影響 克隆形成實(shí)驗(yàn)獲得的克隆和A549細(xì)胞劑量-存活曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，轉(zhuǎn)染shRNA#1和shRNA#2的A549細(xì)胞平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)、離體腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)2 Gy照射后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF2)均顯著低于轉(zhuǎn)染NC-shRNA的A549細(xì)胞(P<0.05)；轉(zhuǎn)染shRNA#1和shRNA#2的A549細(xì)胞的放射增敏比(SER)均大于1。見(jiàn)表1。

圖1 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默F(xiàn)GL1對(duì)A549細(xì)胞放射敏感性的影響

表1 A549細(xì)胞劑量-存活曲線(xiàn)參數(shù)

3 討 論

放療聯(lián)合靶向、免疫、化療等方式可顯著改善晚期NSCLC患者的預(yù)后，并具有增敏免疫療效的作用〔6,7〕。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有64%的NSCLC患者在治療的不同時(shí)期接受過(guò)放療〔8〕。放療主要通過(guò)電離輻射誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂并抑制DNA修復(fù)，有效殺傷或殺滅腫瘤細(xì)胞，降低患者的腫瘤負(fù)荷，其療效主要取決于腫瘤細(xì)胞的放射敏感性〔9〕。然而，隨著放療在NSCLC治療中的普及，出現(xiàn)了不少對(duì)放療不敏感的現(xiàn)象，這種放療抵抗在肺腺癌中尤為明顯，導(dǎo)致其放療效果欠佳〔1～3,10〕。目前對(duì)NSCLC放療抵抗的研究多集中在細(xì)胞周期阻滯與DNA修復(fù)、DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)、腫瘤微環(huán)境的影響等方面〔11,12〕。

在某些腫瘤中，F(xiàn)GL1的表達(dá)變化可以改變細(xì)胞周期〔5〕。在胃癌的研究中，F(xiàn)GL1與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，但不同瘤種中FGL1的表達(dá)和作用可能存在差異〔13,14〕。

本文結(jié)果顯示，F(xiàn)GL1在肺腺癌中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，與Wang等〔4〕研究結(jié)果相一致，驗(yàn)證了FGL1在NSCLC中表達(dá)上調(diào)。通過(guò)癌癥基因組圖譜(TCGA)的進(jìn)一步在線(xiàn)分析也提示FGL1在其他腫瘤，包括乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和結(jié)直腸癌中均有高表達(dá)，提示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的普遍作用〔4〕。D0越小，腫瘤細(xì)胞的放射敏感性越高；Dq體現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞積累亞致死性損傷的能力，等同于克服劑量存活曲線(xiàn)肩區(qū)所需要的劑量；SF2能夠反映腫瘤細(xì)胞的放射敏感性；SER是沉默對(duì)照與沉默組腫瘤細(xì)胞的D0之比，SER大于1表示沉默組相較于沉默對(duì)照組起到了放射增敏的效果。本結(jié)果表明沉默F(xiàn)GL1可以顯著降低A549細(xì)胞對(duì)輻射的抵抗力。

綜上，F(xiàn)GL1在肺腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，沉默F(xiàn)GL1可以增加肺腺癌的放射敏感性。FGL1有可能成為肺腺癌患者放射治療的新靶標(biāo)。