溫度處理對(duì)六堡茶茶苗抗性生理和DNA甲基化水平的影響

葉錦培 陳仕香 唐世斌 黃欣宇 黃愛(ài)萍 黎敏芝 李曉麗

摘要：于25 ℃（CK）、15 ℃和5 ℃條件下，水培六堡茶茶苗1個(gè)月后，測(cè)定葉片中MDA含量，CAT、SOD、POD活性及DNA甲基化水平。結(jié)果表明，溫度從25 ℃降到5 ℃時(shí)，六堡茶茶苗MDA含量、CAT活性和DNA甲基化水平呈現(xiàn)“低-高-低”的趨勢(shì)，15 ℃時(shí)高于對(duì)照組，表明適當(dāng)?shù)蜏貙?duì)MDA含量、CAT活性和DNA甲基化水平有較強(qiáng)的刺激作用，當(dāng)溫度低到一定程度時(shí)，則會(huì)對(duì)其有一定的抑制作用;SOD、POD活性呈現(xiàn)“高-低-高”的趨勢(shì)，15 ℃時(shí)低于對(duì)照組，5 ℃時(shí)高于對(duì)照組，表明適當(dāng)?shù)牡蜏貙?duì)SOD、POD活性有一定的抑制作用，而隨著溫度繼續(xù)降低則會(huì)對(duì)其有促進(jìn)作用。研究結(jié)果有利于了解六堡茶的抗寒機(jī)理，并為六堡茶的耐寒種質(zhì)資源選擇提供參考依據(jù)和理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：溫度;脅迫;抗性生理;DNA甲基化;六堡茶

中圖分類號(hào)：S571.101;TS272

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）16-0164-04

在生長(zhǎng)過(guò)程中，植物可能會(huì)遇到各種環(huán)境脅迫。植物處在逆境狀態(tài)下，其體內(nèi)的活性氧會(huì)大量積累，導(dǎo)致其不能正常生長(zhǎng)，甚至死亡。植物體內(nèi)的保護(hù)酶可以清除過(guò)量的活性氧，維持其動(dòng)態(tài)平衡。保護(hù)酶CAT（過(guò)氧化氫酶）、SOD（超氧化物歧化酶）、POD（過(guò)氧化物酶）在植物抗逆性方面發(fā)揮重要作用。低溫誘導(dǎo)下抗氧化酶基因表達(dá)提高，增強(qiáng)了這些抗氧化酶的活性以維持植物體內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，增強(qiáng)植物對(duì)低溫的抗性。同時(shí)，脅迫下植物葉片中MDA含量也會(huì)增大，膜脂過(guò)氧化加劇，膜透性增強(qiáng)。

DNA甲基化是植物生長(zhǎng)發(fā)育中普遍存在的一種現(xiàn)象。研究植物DNA甲基化與環(huán)境脅迫之間的關(guān)聯(lián)，可為環(huán)境脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響提供理論基礎(chǔ)，為農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)發(fā)展提供指導(dǎo)。

六堡茶因最早產(chǎn)自于廣西梧州市蒼梧縣六堡鎮(zhèn)而得名[1]，其生產(chǎn)歷史悠久，被列為全國(guó)二十四名茶之一[2]。20世紀(jì)50年代，六堡茶主導(dǎo)香港市場(chǎng)，后熱銷東南亞[3]。近年來(lái)，隨著黑茶的消費(fèi)熱潮，六堡茶的年產(chǎn)量和出口量均出現(xiàn)快速增長(zhǎng)[4]。六堡茶的區(qū)域品牌價(jià)值在黑茶類中一直穩(wěn)居前列，梧州市政府出臺(tái)多項(xiàng)政策措施扶持六堡茶的健康可持續(xù)發(fā)展。

六堡茶原產(chǎn)地廣西梧州地處北回歸線以南，氣候溫暖濕潤(rùn)，因此六堡茶對(duì)于低溫的適應(yīng)性相對(duì)較弱，特別是2008年的雨雪冰凍災(zāi)害席卷全國(guó)，六堡茶產(chǎn)區(qū)也不能幸免。隨著全球變暖，近年來(lái)極端天氣和氣候事件頻繁發(fā)生，探討六堡茶對(duì)低溫的抗性以及遭受低溫時(shí)的生理生化變化，對(duì)于六堡茶的選育和栽培乃至產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要意義。本研究通過(guò)在不同溫度環(huán)境下對(duì)六堡茶茶苗進(jìn)行水培，探討低溫脅迫下六堡茶茶苗的抗性生理和DNA甲基化水平差異，不僅可揭示六堡茶的抗寒機(jī)理，同時(shí)為六堡茶的耐寒種質(zhì)資源選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本次試驗(yàn)材料選自廣西蒼梧縣國(guó)有天洪嶺林場(chǎng)六堡茶六堡群體種扦插苗，所選茶苗長(zhǎng)勢(shì)大體一致（苗高約30 cm）。把茶苗根系土壤洗凈后放入盛有1 L 1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水桶中水培，使茶苗適應(yīng)水培環(huán)境，期間每周更換營(yíng)養(yǎng)液。水培1個(gè)月后，將茶苗分別置于全光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置3個(gè)處理，分別為5 ℃、15 ℃和25 ℃（CK），每處理3個(gè)重復(fù)水桶，每個(gè)水桶放置茶苗11株。在恒溫條件下培養(yǎng)1個(gè)月，每周更換營(yíng)養(yǎng)液。每日光照時(shí)間為12 h（07：00—19：00），光照度為7 500 lx。各處理1個(gè)月后，茶苗都長(zhǎng)出嫩葉，采集枝條頂部新長(zhǎng)出的2～3張嫩葉和芽保存在4 ℃低溫下用以測(cè)定生物指標(biāo)。

1.2 抗性生理指標(biāo)測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒提取MDA、CAT、SOD和POD，提取步驟參照試劑盒說(shuō)明書。采用TBA法測(cè)定MDA含量，采用可見(jiàn)光法測(cè)定CAT、POD活性，采用羥胺法測(cè)定SOD活性。

1.3 DNA甲基化水平

1.3.1 DNA提取 六堡茶茶苗葉片基因組DNA的提取采用康為世紀(jì)生物科技有限公司的新型植物基因組DNA試劑盒，提取步驟參照試劑盒說(shuō)明書，提取的DNA保存于-20 ℃下。取10 μL DNA提取液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定D260 nm和D280 nm，以D260 nm估算DNA產(chǎn)率，D260 nm/D280 nm判斷DNA樣品純度。

1.3.2 DNA甲基化水平測(cè)定 六堡茶茶苗葉片DNA中5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶的測(cè)定主要參照黑淑梅等的方法[5]，首先配制好2 mol/L HCl溶液和 4 mol/L NaOH溶液各1 L。移取上述DNA溶液 20 μL于1.5 mL離心管中，再吸取20 μL 2 mol/L HCl于其離心管中，于恒溫水浴鍋中80 ℃水解 120 min，水解后吸取20 μL 4 mol/L NaOH于離心管中以中和HCl，4 000 r/min離心分離1 min，移取上清液于新的離心管中，待測(cè)5-甲基胞嘧啶（5-MeC）的含量。

將50 mg胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶解于500 μL的TE緩沖液中（濃度為100 μg/μL），再取0.75 μL溶于1.5 mL TE緩沖液配制成濃度為50 μg/μL的胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液。5-甲基胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液也以相同方式制備。

用高效液相色譜法測(cè)定六堡茶茶苗DNA甲基化水平。色譜柱：Hypersil BDS-C18鍵合柱（5 μm，150 mm×46 mm）。流動(dòng)相的組成成分：5%甲醇，4.75 mmol/L己烷磺酸鈉，0.2%三乙醇胺。流動(dòng)相用娃哈哈純凈水配制，再用磷酸將其pH值調(diào)為5.5。流速：0.7 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm，進(jìn)樣量：10 μL，運(yùn)行時(shí)間：15 min。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量分別為2、4、6、8、10 μL，其對(duì)應(yīng)的濃度為10、20、30、40、50 μg/μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

六堡茶茶苗葉片DNA的胞嘧啶（C）和5-甲基胞嘧啶（5-MeC）的含量，運(yùn)用外標(biāo)準(zhǔn)法計(jì)算。先比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，再根據(jù)公式[5-MeC/（C+5-MeC）]×100%計(jì)算5-MeC的百分含量。用MS Excel 2007對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后，用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對(duì)六堡茶茶苗抗性生理的影響

2.1.1 MDA含量 從對(duì)照溫度（25 ℃）降到5 ℃時(shí)，MDA含量呈現(xiàn)“低—高—低”的趨勢(shì)（圖1-A）。對(duì)照MDA含量為117.66 nmol/g，15 ℃時(shí)MDA含量高于對(duì)照組73.07%（203.63 nmol/g），而5 ℃時(shí)則低于對(duì)照組22.37%（91.34 nmol/g）。適當(dāng)?shù)牡蜏貙?duì)MDA有較強(qiáng)的刺激作用，當(dāng)溫度低到一定程度時(shí)，則對(duì)MDA有一定的抑制作用。

2.1.2 CAT活性 從對(duì)照溫度（25 ℃）降到 5 ℃ 時(shí)，CAT活性呈現(xiàn)“低-高-低”的趨勢(shì)（圖1-B）。對(duì)照CAT活性為2.25 U/mg，15 ℃時(shí)CAT活性高于對(duì)照組64.44%（3.70 U/mg），而5 ℃時(shí)則低于對(duì)照組19.11%（1.82 U/mg）。適當(dāng)?shù)牡蜏貙?duì)CAT有較強(qiáng)的刺激作用，當(dāng)溫度低到一定程度時(shí)，則對(duì)CAT有一定的抑制作用。

2.1.3 SOD活性 從對(duì)照溫度（25 ℃）降到 5 ℃ 時(shí)，SOD活性呈現(xiàn)“高—低—高”的趨勢(shì)（圖1-C）。對(duì)照SOD活性為1.97 U/mg，15 ℃時(shí)SOD活性低于對(duì)照組7.11%（1.83 U/mg），而5 ℃時(shí)則高于對(duì)照組4.06%（2.05 U/mg）。適當(dāng)?shù)牡蜏貙?duì)SOD有一定的抑制作用，溫度為5 ℃時(shí)對(duì)SOD有促進(jìn)作用。

2.1.4 POD活性 從對(duì)照溫度（25 ℃）降到 5 ℃ 時(shí)，POD活性呈現(xiàn)“高—低—高”的趨勢(shì)（圖1-D）。對(duì)照POD活性為0.18 U/mg，15 ℃時(shí)POD活性低于對(duì)照組55.56%（0.08 U/mg），而5 ℃時(shí)則高于對(duì)照組11.11%（0.20 U/mg）。適當(dāng)?shù)牡蜏貙?duì)POD有一定的抑制作用，隨著溫度的繼續(xù)降低對(duì)POD有刺激作用。

2.2 低溫對(duì)六堡茶茶苗DNA 5-甲基化的影響

如圖2-A和2-B，以濃度（μg/μL）為橫坐標(biāo)，峰面積（×10 000）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)品胞嘧啶的線性方程為y=12 590x+3 212，r2=0.999 6;標(biāo)準(zhǔn)品5-甲基胞嘧啶線性方程為y=37 715x-16 156，r2=0.999 6;說(shuō)明胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶在0～50 μg/μL范圍內(nèi)，分別都有良好的線性關(guān)系。

從對(duì)照溫度（25 ℃）降到5 ℃時(shí)，六堡茶DNA甲基化水平呈現(xiàn)“低-高-低”的趨勢(shì)，如圖3所示。對(duì)照組DNA甲基化水平為9.79%，15 ℃時(shí)為27.36%，高于對(duì)照組179.47%，而5 ℃時(shí)為24.14%，高于對(duì)照組146.58%。結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)牡蜏貙?duì)DNA甲基化水平有一定刺激作用，當(dāng)溫度低到一定程度時(shí)，則對(duì)DNA甲基化水平有一定的抑制作用。

3 討論與結(jié)論

3.1 低溫脅迫對(duì)六堡茶茶苗抗性生理的影響

活性氧是與氧代謝有關(guān)過(guò)程的中間產(chǎn)物，其中以自由基形式存在的活性氧會(huì)導(dǎo)致植物不能正常生長(zhǎng)發(fā)育，加速植物衰老，甚至導(dǎo)致死亡[6]。六堡茶茶苗體內(nèi)的活性氧和活性氧清除系統(tǒng)，在正常情況下能夠保持著動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)遭受到脅迫時(shí)，六堡茶茶苗的光合作用受阻，部分氧氣被作為電子受體形成超氧陰離子自由基（O-2·），其體內(nèi)就會(huì)累積超過(guò)動(dòng)態(tài)平衡的活性氧，超越活性氧清除系統(tǒng)的能力范圍，就會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，使六堡茶茶苗的生長(zhǎng)受阻。

CAT、SOD和POD是六堡茶茶苗體內(nèi)酶催清除系統(tǒng)中的主要成員。在清除活性氧時(shí)，SOD是第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶，催化O-2·發(fā)生歧化反應(yīng)，產(chǎn)生H2O2和水。CAT和POD可以阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過(guò)不同的方式把H2O2分解為水和氧氣。六堡茶茶苗體內(nèi)非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基，能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并由此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，使茶苗組織細(xì)胞受損傷。MDA是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物，作為膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，直接反映六堡茶茶苗的受損程度。

本研究表明，隨著溫度降低，MDA含量先呈現(xiàn)上升狀態(tài)，膜脂過(guò)氧化程度增大，在15 ℃后開(kāi)始下降，膜脂過(guò)氧化程度減小，說(shuō)明15 ℃的低溫對(duì)六堡茶茶苗的生長(zhǎng)有抑制作用，受損程度最大。隨著溫度降低，六堡茶茶苗的CAT活性先增加后降低，SOD和POD則隨著溫度的降低先下降后上升。當(dāng)SOD和POD活性較低時(shí)，為了維持活性氧與活性氧清除系統(tǒng)的平衡，CAT活性增大，在維持活性氧平衡中發(fā)揮主要作用。在15 ℃時(shí)，SOD和POD活性降低的原因目前尚不明確，推測(cè)可能與茶苗對(duì)低溫的適應(yīng)機(jī)制有關(guān)，15 ℃可以導(dǎo)致酶活性的下降但并不足以使SOD和POD在茶苗體內(nèi)高度表達(dá)。同時(shí)，SOD、POD活性與MDA含量緊密相關(guān)[7]，MDA是自由基引起的膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，而SOD則是清除自由基的主要抗氧化酶[8]，隨著溫度降低，六堡茶茶苗的MDA含量先升高后降低，SOD活性先下降后升高，兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。低溫抑制了六堡茶茶苗的SOD活性，使活性氧大量積累，MDA含量增大，加大了膜脂過(guò)氧化程度，破壞了膜的完整性，使得茶苗葉片不能正常生長(zhǎng)，進(jìn)而危害六堡茶茶苗的整體。

3.2 低溫脅迫對(duì)六堡茶茶苗DNA甲基化水平的影響

DNA甲基化是六堡茶茶苗調(diào)控其基因表達(dá)的重要手段之一，在低溫馴化過(guò)程中，某些與耐寒相關(guān)的基因被激活，從而使六堡茶茶苗適應(yīng)低溫逆境。Choi等的研究表明，低溫脅迫下植物的相關(guān)抗逆基因發(fā)生去甲基化，增加相應(yīng)基因的表達(dá)量來(lái)應(yīng)對(duì)低溫逆境[9]。因此，低溫（15 ℃和5 ℃）下，六堡茶茶苗為了適應(yīng)低溫而使基因組總體上趨向于去甲基化從而調(diào)控某些耐寒基因表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了六堡茶茶苗對(duì)低溫的適應(yīng)性。周艷華等利用MSAP技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，低溫處理期間茶樹(shù)樣品和低溫處理之后茶樹(shù)樣品，其基因組DNA同時(shí)發(fā)生甲基化和去甲基化，甲基化水平高于去甲基化水平，因此總體甲基化水平呈現(xiàn)增加趨勢(shì)[10]，這與本研究結(jié)果相一致。

低溫脅迫下，六堡茶茶苗DNA甲基化水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，可能是因?yàn)闇囟葟?5 ℃降到15 ℃，對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶、染色質(zhì)甲基化酶和重新甲基化酶的活性抑制不大，甚至還有所促進(jìn)，從而提高了六堡茶茶苗DNA甲基化水平。當(dāng)溫度進(jìn)一步降低，則抑制了這些參與DNA甲基化酶的活性，從而使六堡茶茶苗的DNA甲基化水平有所降低。

本研究分別于25 ℃、15 ℃和5 ℃下水培六堡茶茶苗，測(cè)定葉片中MDA含量，CAT、SOD和POD活性以及葉片中DNA甲基化水平。研究表明，適當(dāng)?shù)蜏貙?duì)六堡茶茶苗葉片中MDA含量、CAT活性和DNA甲基化水平有較強(qiáng)的刺激作用，當(dāng)溫度低到一定程度時(shí)，則會(huì)對(duì)其有一定的抑制作用。同時(shí)，適當(dāng)?shù)牡蜏貙?duì)六堡茶茶苗葉片中SOD和POD活性也有一定的抑制作用，而隨著溫度繼續(xù)降低，則會(huì)對(duì)其有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果不僅可以揭示六堡茶的抗寒機(jī)理，而且可為六堡茶的耐寒種質(zhì)資源選擇提供理論指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]龍志榮，邱瑞瑾，馬士成，等. 六堡茶研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)茶葉加工，2017（1）：40-45.

[2]龍志榮，馬士成，梅 宇，等. 2013年全國(guó)六堡茶產(chǎn)銷形勢(shì)分析報(bào)告[J]. 茶世界，2013（7）：16-22.

[3]溫志杰，石榮強(qiáng)，何勇強(qiáng)，等. 六堡茶渥堆過(guò)程中微生物種群變化的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：1009-1011.

[4]陳小強(qiáng)，葉 陽(yáng)，成 浩，等. 六堡茶的理化分析研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008（7）：77-80.

[5]黑淑梅. 重金屬鉻對(duì)小麥根系DNA甲基化水平的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，37（2）：14-15，26.

[6]陳巧艷，李迎迎，陳劉平，等. 低溫脅迫對(duì)不同小麥品種結(jié)實(shí)率和活性氧代謝的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（11）：63-65.

[7]王寶山，趙思齊. 干旱對(duì)小麥幼苗膜脂過(guò)氧化及保護(hù)酶的影響[J]. 山東師大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1987（1）：29-38.

[8]勾曉華，王勛陵. 氟化氫對(duì)植物葉片中SOD酶活力和MDA含量的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，1995（5）：71-76.

[9]Choi C S，Sano H. Abiotic-stress induces demethylation and transcriptional activation of ageneencoding a glycero phosphodie sterase-like protein in tobacco plants[J]. Molecular Genetics and Genomics，2007，277（5）：589-600.

[10]周艷華，曹紅利，岳 川，等. 冷馴化不同階段茶樹(shù)DNA甲基化模式的變化[J]. 作物學(xué)報(bào)，2015（7）：1047-1055.