（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 血管外科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

放療所致頸動(dòng)脈炎是頭頸惡性腫瘤放療患者卒中新的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。放療會(huì)造成照射野內(nèi)血管損傷，其動(dòng)脈損傷導(dǎo)致動(dòng)脈血管狹窄會(huì)引起患者出現(xiàn)一過(guò)性黑朦、輕癱、感覺障礙等癥狀，嚴(yán)重狹窄會(huì)增加發(fā)生腦血管事件的風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。因此，早期減輕放療性頸動(dòng)脈炎，可減緩頸動(dòng)脈狹窄發(fā)展進(jìn)程，從而降低腦卒中發(fā)生率。放射線對(duì)血管內(nèi)皮損傷致巨噬細(xì)胞的活化是放療后動(dòng)脈炎發(fā)生的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，輻射刺激可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體活化，從而促進(jìn)細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-18[4]。姜黃素?zé)熕狨ナ墙S素和煙酸兩者結(jié)合形成的新型化合物，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等諸多藥理作用。研究表明，姜黃素在炎癥疾病中能起到良好的抗炎作用[5-6]。因此，本實(shí)驗(yàn)以巨噬細(xì)胞作為模型，通過(guò)射線照射巨噬細(xì)胞，以姜黃素?zé)熕狨ジ深A(yù)，觀察其對(duì)放療后炎癥介質(zhì)釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

姜黃素?zé)熕狨ビ珊现嗅t(yī)藥大學(xué)庹勤慧老師贈(zèng)送，將其溶于二甲基亞砜 （DMSO） 中，儲(chǔ)液濃度為1.0 μmol/L。實(shí)驗(yàn)所用一抗為多克隆兔抗人白細(xì)胞介素-1β （IL-1β） （ab2105） 、兔抗人白細(xì)胞介素-18 （IL-18） （ab71495） 、鼠抗人β-actin （ab8227） 購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，巨噬細(xì)胞 （RAW264.7） 由南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)中心所有，高糖DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天有限公司，Western blotting 發(fā)光液購(gòu)自北京英格恩生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自廣州七星生物科技有限公司，Siemens Primus 直線加速器購(gòu)自德國(guó)西門子公司，參數(shù)設(shè)定為6 MVX，吸收劑量為200 Gy/min，源皮距為100 cm。

1.2 方法

1.2.1 照射劑量常規(guī)對(duì)RAW264.7 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。RAW264.7 細(xì)胞的照射劑量為200 Gy/min。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞給予不同劑量 （0、2、4和8 Gy） 的照射，照射完畢后，提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用Western blotting 檢測(cè)IL-1β、IL-18的表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞分組分為空白對(duì)照組 （0.0 μmol/L） 、單純照射組 （Vector） 、姜黃素?zé)熕狨ゲ煌瑵舛冉M （1.0、3.0和9.0 μmol/L）?？瞻讓?duì)照組和單純照射組照射前不給予藥物干預(yù)，姜黃素?zé)熕狨ゲ煌瑵舛冉M照射前1 h 預(yù)先給予不同濃度的姜黃素?zé)熕狨?，照射?4 h提取細(xì)胞總蛋白行進(jìn)一步檢測(cè)。

1.2.3 Westernblotting 檢測(cè)照射后24 h 收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量檢測(cè)按BCA 蛋白定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。取25 mg 蛋白上樣進(jìn)行SDSPAGE 電泳，80 V 穩(wěn)壓轉(zhuǎn)膜，以含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育后，洗膜加入相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光 （ECL） 法檢測(cè)。以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7 細(xì)胞消化后進(jìn)行稀釋，并計(jì)算濃度，按10 000個(gè)/孔細(xì)胞接種于64孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。貼壁過(guò)夜后去除培養(yǎng)基，加入根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要配置的梯度濃度姜黃素?zé)熕狨ィ靠?00 μl。24 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100 μl及CCK-8 試劑10 μl，注意不要留有氣泡。培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)30 min，然后立即取出置于酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)吸光度值，以3個(gè)復(fù)孔平均值作為每個(gè)樣本最終結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)說(shuō)明書計(jì)算生存分?jǐn)?shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最適照射劑量

射線照射后內(nèi)IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)水平升高 （見圖1、2）。以0、2、4和8 Gy 劑量放射線照射RAW264.7 細(xì)胞后，各組IL-1β的蛋白表達(dá)水平分別為 （0.157±0.009） 、 （0.387±0.010） 、 （0.437±0.010）和 （0.396±0.010），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=436.534，P=0.000）。2、4和8 Gy組分別與0 Gy組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。各組IL-18的蛋白表達(dá)水平分別為 （0.899±0.004） 、 （1.074±0.044） 、 （1.375±0.038）和 （1.240±0.041），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=74.762，P=0.000）。2、4和8 Gy組分別與0 Gy組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。IL-1β、IL-18表達(dá)水平在0～4 Gy 照射劑量范圍隨照射劑量增加而升高，而8 Gy 照射后有所下降，因此4 Gy 是最適照射劑量。

2.2 姜黃素?zé)熕狨?duì)照射后RAW264.7 細(xì)胞IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)的影響

行CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃素?zé)熕狨ゲ煌瑵舛冉M生存率，結(jié)果顯示各組生存率＞80%。見圖3。

圖1 不同劑量放射線照射后RAW264.7 細(xì)胞的IL-1β 蛋白表達(dá)

圖2 不同劑量放射線照射后RAW264.7 細(xì)胞的IL-18蛋白表達(dá)

圖3 不同濃度姜黃素?zé)熕狨?duì)RAW264.7 細(xì)胞毒性的影響 （±s）

照射前1 h分別給予1.0、3.0和9.0 μmol/L 姜黃素?zé)熕狨?，再?jīng)最適照射劑量4 Gy 照射，24 h后提取蛋白，空白對(duì)照組 （0.0 μmol/L） 、單純照射組 （Vector） 、姜黃素?zé)熕狨ゲ煌瑵舛冉M （1.0、3.0和9.0 μmol/L） IL-1β的蛋白表達(dá)水平分別為 （0.244±0.008） 、 （0.580±0.012） 、 （0.419±0.012） 、 （0.333±0.025）和 （0.439±0.003），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=235.134，P=0.000），各組IL-1β的蛋白表達(dá)水平分別與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），各組IL-1β的蛋白表達(dá)水平分別與單純照射組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見圖4。

由圖5示：空白對(duì)照組 （0.0 μmol/L） 、單純照射組 （Vector） 、姜黃素?zé)熕狨ゲ煌瑵舛冉M （1.0、3.0和9.0 μmol/L） IL-18的蛋白表達(dá)的水平分別為 （0.454±0.006） 、 （0.711±0.010） 、 （0.463±0.016） 、 （0.385±0.018） 及 （0.361±0.023），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=182.243，P=0.000）。各組IL-18的蛋白表達(dá)水平分別與空白對(duì)照組比較，除1.0 μmol/L組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），其余組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05） ；各組IL-18的蛋白表達(dá)水平分別與單純照射組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。

圖4 各組RAW264.7 細(xì)胞IL-1β 蛋白的表達(dá)

圖5 各組RAW264.7 細(xì)胞IL-18蛋白的表達(dá)

3 討論

放療引起的血管損傷機(jī)制是放射線導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，釋放炎癥介質(zhì)導(dǎo)致動(dòng)脈炎性損傷。抑制巨噬細(xì)胞的活化、減少炎癥因子釋放，可減輕放射性動(dòng)脈損傷，延緩頸動(dòng)脈狹窄的發(fā)生。研究表明抗炎、抗氧化、抗免疫調(diào)節(jié)是姜黃素諸多藥理作用之一[7]。JAIN 等[8]研究表明，在姜黃素干預(yù)后糖尿病大鼠的炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)水平下降。姜黃素的缺點(diǎn)是其體內(nèi)代謝消除快、生物利用度低，臨床應(yīng)用受到限制。調(diào)節(jié)炎癥因子藥物煙酸單用有皮膚潮紅、瘙癢、肝功能損害等副作用。因此，將姜黃素和煙酸兩者結(jié)合形成新型化合物姜黃素?zé)熕狨ィ沙浞职l(fā)揮煙酸的調(diào)節(jié)炎癥因子以及姜黃素的抗炎作用，可提高其生物利用度，減輕副反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞層面探討姜黃素?zé)熕狨?duì)炎癥因子IL-1β、IL-18的抑制作用，證明其可作為輻射防護(hù)藥物。

本研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞在受到射線照射后，隨著照射劑量的增大，細(xì)胞IL-1β、IL-18蛋白的表達(dá)升高，于4 Gy 照射劑量時(shí)達(dá)到峰值，但是當(dāng)照射劑量達(dá)8 Gy時(shí)，IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)反而下降，究其原因可能為大劑量射線照射時(shí)細(xì)胞損傷增加，從而影響細(xì)胞的活性進(jìn)而導(dǎo)致IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)降低，因此4 Gy 是其最適照射劑量。在4 Gy 射線照射前預(yù)先給予不同濃度的姜黃素?zé)熕狨ィS著姜黃素?zé)熕狨┝吭黾?，IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)水平降低，提示姜黃素?zé)熕狨タ蓽p少輻射誘導(dǎo)的IL-1β、IL-18的表達(dá)，減輕細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

本研究中未涉及細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌型IL-1β、IL-18表達(dá)的檢測(cè)，這也正是本課題組進(jìn)一步研究的內(nèi)容。包括放療前后及姜黃素?zé)熕狨ジ深A(yù)處理后培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18表達(dá)的變化；同時(shí)，可以收集臨床患者接受放療前后的血清，檢測(cè)IL-1β、IL-18的表達(dá)變化。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)4 Gy 照射巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)，一定劑量的姜黃素?zé)熕狨タ山档洼椛浜缶奘杉?xì)胞IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)水平，抑制炎癥反應(yīng)，具有較好的輻射防護(hù)作用。