（承德市中心醫(yī)院 耳鼻喉科，河北 承德 067000）

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，近年全球喉癌的發(fā)病率明顯升高[1-2]。喉癌主要采取以手術(shù)為主的綜合治療[2]，盡管目前的治療手段有所改善，但是預后仍較差[3-4]。目前歐美國家非手術(shù)保喉治療已成為中晚期喉癌患者根治性治療的一種方式，而非輔助性治療[5]。單純的化療是治療中晚期喉癌的重要方法之一。順鉑作為喉癌化療的一線用藥，在腫瘤治療中有著重要作用，但耐藥的出現(xiàn)限制其應用，因此尋找能夠增敏順鉑的治療方法有重要臨床意義。近年熱療與化療聯(lián)合抗癌成為研究熱點。研究顯示熱療聯(lián)合化療在卵巢癌、食管癌、胃癌等的治療中已廣泛開展并獲得較好的臨床效果[6-8]，且熱療相對安全、無毒。本研究擬在體外培養(yǎng)條件下觀察熱療聯(lián)合順鉑對喉癌Hep-2細胞增殖、遷移和侵襲力的影響，旨在為喉癌的治療提供新思路、新方法，為熱療聯(lián)合化療治療喉癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

喉癌Hep-2細胞由天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院提供，RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco Invitrogen公司，胎牛血清購自天津血液學研究所，胰蛋白酶購自美國Sigma公司，順鉑購自山東齊魯制藥有限公司，MTT 購自武漢華美生物技術(shù)有限公司，Transwell 侵襲實驗用細胞外基質(zhì)膠 （ECM） 購自美國Sigma公司，孔徑為8 μm的Transwell 小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 喉癌Hep-2細胞的培養(yǎng)及其對順鉑的敏感性檢測用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳CO2中常規(guī)培養(yǎng)、傳代喉癌Hep-2細胞。收集處于對數(shù)生長期的細胞，實驗分6組：①陰性對照組 （培養(yǎng)基不加順鉑） ；②0.004 mg/L組 （順鉑濃度0.004 mg/L） ；③0.040 mg/L組 （順鉑濃度0.040 mg/L） ；④0.400 mg/L組 （順鉑濃度0.400 mg/L） ；⑤4.000 mg/L組 （順鉑濃度4.000 mg/L） ；⑥40.000 mg/L組 （順鉑濃度40.000 mg/L）。以2×105個/ml 密度接種于96孔板，每孔加入100 μl細胞懸液，每組設(shè)6個復孔。5% CO2、37℃、飽和濕度條件下孵育24 h后，陰性對照組繼續(xù)培養(yǎng)24 h；②～⑥組換為含對應濃度順鉑的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸棄各孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入不含血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基100 μl，MTT 溶液 （5 mg/ml） 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μl 二甲基亞砜 （DMSO），低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標儀在波長490 nm處測量各孔的光密度 （optical density，OD） 值，計算順鉑對喉癌Hep-2細胞的IC50。

1.2.2 MTT法檢測Hep-2細胞的增殖收集處于對數(shù)生長期的細胞，分為4組：①對照組 （置于37℃培養(yǎng)箱） ；②熱療組 （置于43℃培養(yǎng)箱） ；③順鉑組 （置于37℃培養(yǎng)箱并加入順鉑，順鉑的濃度為4.000 mg/L） ；④熱療聯(lián)合順鉑組 （43℃培養(yǎng)箱并加入順鉑，順鉑的濃度為4.000 mg/L）。以2×105個/ml 密度接種于96孔板，每孔加入100 μl 細胞懸液，每組設(shè)6個復孔。37℃、5% CO2飽和濕度條件下孵育24 h后，對照組于37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h；熱療組于43℃作用2 h后重新置于37℃繼續(xù)培養(yǎng)22 h；順鉑組于37℃并加入順鉑 （順鉑濃度為4.000 mg/L） 繼續(xù)培養(yǎng)24 h；熱療聯(lián)合順鉑組于43℃并加入順鉑 （順鉑濃度為4.000 mg/L），2 h后重新置于37℃繼續(xù)培養(yǎng)22 h。MTT法同上。用酶標儀在波長490 nm處測量各孔的OD值。按照2×2 析因?qū)嶒炘O(shè)計，2個因素分別為熱療和順鉑，熱療有2個水平，分別為37和43℃；順鉑有2個水平，分別為順鉑濃度0.000 mg/L和順鉑濃度4.000 mg/L。

1.2.3 Wound-healing劃痕實驗檢測Hep-2細胞的遷移Hep-2細胞按上述分組接種到6孔板，每孔的培養(yǎng)體積為3 ml，細胞數(shù)大約為5×105個/ml，37℃、5% CO2飽和濕度條件下孵育12 h。用200 μl 移液器在已經(jīng)鋪滿的單層細胞上劃痕，磷酸鹽緩沖液 （PBS） 清洗3次，洗掉漂浮的細胞。對照組、熱療組用3 ml無血清RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，順鉑組、熱療聯(lián)合順鉑組用3 ml 無血清含4.000 mg/L 順鉑的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在0和24 h 拍照，實驗重復3次。

1.2.4 Transwell 侵襲實驗檢測Hep-2細胞的侵襲力分組同1.2.2，收集處于對數(shù)生長期的細胞，隨機分為4組，以2×105個/ml的密度接種于30 mm2平皿，37℃、5%CO2飽和濕度條件下孵育24 h后，對照組于37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h；熱療組于43℃作用2 h后重新置于37℃繼續(xù)培養(yǎng)22 h；順鉑組于37℃并加入順鉑 （順鉑濃度為4.000 mg/L） 繼續(xù)培養(yǎng)24 h；熱療聯(lián)合順鉑組于43℃并加入順鉑 （濃度為4.000 mg/L），2 h后重新置于37℃繼續(xù)培養(yǎng)22 h。采用Transwell 侵襲實驗法[9]，將人工細胞外基質(zhì)膠 （ECM） 按1∶4 比例用無血清的培養(yǎng)基稀釋后，每室100 μl 均勻鋪于小室膜上，將小室置于24孔板中，上室加入70 μl 無血清培養(yǎng)基，37℃靜置30 min，使基質(zhì)膠水化后吸去剩余培養(yǎng)液。將4組細胞消化并計數(shù)，調(diào)整密度至2×105個/ml，取細胞懸液200 μl 加入上室。下室加入600 μl 含30%血清的培養(yǎng)基。24 h后取出小室，PBS 清洗2 遍，棉簽擦去ECM和上室內(nèi)的細胞，甲醇固定15 min，蘇木精染色，顯微鏡下觀察，隨機選擇5個視野計數(shù)，取每組的平均值為Hep-2細胞的穿膜細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差 （±s）表示，比較用單因素方差分析或析因設(shè)計方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Hep-2細胞對順鉑的敏感性

6組細胞進行MTT處理，測波長490 nm處OD值分別為 （1.24±0.13） 、 （1.22±0.08） 、 （1.18±0.08），（1.09±0.08） 、 （0.75±0.07） 及 （0.25±0.03），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義 （F=130.925，P=0.000） ；40.000 mg/L組OD值低于其他組 （P＜0.05） ；4.000 mg/L組OD值均低于0.400 mg/L組、0.040 mg/L組、0.004 mg/L組和陰性對照組 （P＜0.05） ；0.400 mg/L組OD值低于0.004 mg/L組和陰性對照組 （P＜0.05），與0.040 mg/L組比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05） ；0.040 mg/L組、0.004 mg/L組和陰性對照組OD值比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05） （見圖1）。順鉑對喉癌Hep-2細胞的IC50為19.555 mg/L。

圖1 Hep-2細胞對順鉑的敏感性 （±s）

2.2 熱療聯(lián)合順鉑對Hep-2細胞增殖的影響

4組細胞進行MTT處理，測波長490 nm處OD值分別為 （1.24±0.13） 、 （0.99±0.11） 、 （0.75±0.07） 及 （0.31±0.07），析因分析顯示，不同溫度熱療在波長490 nm處的OD值有差異 （F=73.665，P=0.000），不同濃度順鉑在波長490 nm處的OD值有差異 （F=213.005，P=0.000），熱療與順鉑對在波長490 nm處的OD值存在交互作用 （F=5.071，P=0.036）。見圖2和表1。

2.3 熱療聯(lián)合順鉑對Hep-2細胞遷移的影響

4組細胞未愈合區(qū)百分比分別為 （31.83±1.62） %、 （40.47±1.52） %、 （53.13±2.61） %及 （79.83±0.95） %，析因分析顯示，不同溫度熱療的未愈合區(qū)百分比有差異 （F=296.934，P=0.000），不同濃度順鉑的未愈合區(qū)百分比有差異 （F=875.370，P=0.000），熱療與順鉑對未愈合區(qū)百分比的影響存在交互作用 （F=77.633，P=0.000）。見表1和圖3、4。

圖2 各組Hep-2細胞的OD值比較 （±s）

表1 各組Hep-2細胞的增殖、遷移和侵襲力 （±s）

表1 各組Hep-2細胞的增殖、遷移和侵襲力 （±s）

組別 因素A 因素B OD值 未愈合區(qū)百分比/% 穿膜細胞數(shù)/個對照組 熱療 （37℃） 順鉑 （0 mg/L） 1.24±0.13 31.83±1.62 27.8±1.64熱療組 熱療 （43℃） 順鉑 （0 mg/L） 0.99±0.11 40.47±1.52 21.8±1.48順鉑組 熱療 （37℃） 順鉑 （4 mg/L） 0.75±0.07 53.13±2.61 11.2±1.48熱療聯(lián)合順鉑組 熱療 （43℃） 順鉑 （4 mg/L） 0.31±0.07 79.83±0.95 1.8±0.84

2.4 熱療聯(lián)合順鉑對喉癌Hep-2細胞侵襲力的影響

4組細胞穿過Transwell 小室膜的細胞數(shù)目分別為 （27.8±1.64） 、 （21.8±1.48） 、 （11.2±1.48） 及 （1.8±0.84） 個，析因分析顯示，不同溫度熱療的穿膜細胞數(shù)有差異 （F=152.026，P=0.000），不同濃度順鉑的穿膜細胞數(shù)有差異 （F=858.692，P=0.000），熱療與順鉑對穿膜細胞數(shù)的影響存在交互作用 （F=7.410，P=0.015）。見表1和圖5、6。

圖3 各組Hep-2細胞的遷移 （×100）

圖4 各組Hep-2細胞未愈合區(qū)百分比比較 （±s）

圖5 各組Hep-2細胞穿膜細胞數(shù)比較 （±s）

圖6 各組Hep-2細胞的侵襲力 （蘇木精染色×200）

3 討論

我國喉癌發(fā)病率約為26/10萬，占全身惡性腫瘤的0.6%，病死率約為15/10萬，占全身腫瘤的0.5%[10]。喉癌容易局部復發(fā)和/或遠處轉(zhuǎn)移，導致預后不良和治療失敗[10]。順鉑是一種細胞周期非特異性細胞毒性藥物，DNA為其主要靶點，通過破壞腫瘤細胞DNA的正常結(jié)構(gòu)，阻止DNA的復制，誘導腫瘤細胞的凋亡[11]。早期對順鉑敏感的腫瘤在長期臨床應用中逐漸產(chǎn)生耐藥，限制其應用。而高溫熱療是利用物理療法，使組織加熱，達到殺滅癌細胞的溫度，以治療惡性腫瘤。被認為是繼手術(shù)、放療、化療、生物免疫療法之后的第5種腫瘤治療方法。臨床應用無毒、安全，也稱為綠色治療[12]。

本研究采用MTT 比色法研究熱療聯(lián)合順鉑對喉癌Hep-2細胞增殖的影響。MTT 可以被活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶還原成水不溶性的甲瓚結(jié)晶，并沉積在細胞中。結(jié)晶溶于DMSO，經(jīng)酶標儀檢測后的OD值可間接反映活細胞數(shù)。本實驗4組Hep-2細胞進行MTT處理，結(jié)果顯示：熱療與順鉑均可以抑制Hep-2細胞增殖，熱療與順鉑聯(lián)合對Hep-2細胞增殖的抑制有交互作用，表明熱療與順鉑聯(lián)合有協(xié)同抗腫瘤作用。由此推測，熱療聯(lián)合化療的作用機制有可能是：①熱療通過殺傷處于S期腫瘤細胞的方式抑制腫瘤增殖。②熱療改變腫瘤細胞膜的結(jié)構(gòu)，有利于化療藥物進入腫瘤細胞，進而增加腫瘤細胞內(nèi)的藥物濃度[13]，從而增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。

腫瘤細胞的侵襲是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要步驟，是惡性腫瘤最本質(zhì)特征之一，抑制腫瘤的侵襲力可控制或降低腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。細胞外基質(zhì)的降解是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。本研究結(jié)果顯示，熱療與順鉑均可以降低Hep-2細胞遷移和侵襲能力，熱療與順鉑聯(lián)合對Hep-2細胞遷移及侵襲的抑制有交互作用，表明熱療與順鉑聯(lián)合有協(xié)同抗腫瘤侵襲作用。有研究顯示，熱化療可能通過抑制腫瘤細胞外基質(zhì)降解，抑制腫瘤源性血管內(nèi)皮細胞增生和細胞外基質(zhì)再塑，從而抑制腫瘤細胞的擴散轉(zhuǎn)移[14]。筆者推測其機制可能為：熱療聯(lián)合順鉑抑制腫瘤細胞，產(chǎn)生某些能夠影響細胞外基質(zhì)形成物質(zhì)的能力，或者對具有降解細胞外基質(zhì)功能的蛋白產(chǎn)生抑制作用，從而抑制腫瘤細胞的侵襲力。但具體的機制仍待進一步研究來證實。

綜上所述，熱療與順鉑2種治療方案聯(lián)合應用有協(xié)同作用，熱療可以提高順鉑對Hep-2細胞的敏感性。熱療聯(lián)合順鉑抑制喉癌Hep-2細胞的增殖，降低Hep-2細胞的遷移及侵襲力，從而為喉癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)，但具體機制尚待進一步研究。