蘇 博，付春情，韓旺旺，劉嘯宇，陳鳳瑞，姚沛琳，徐禮生，王文婷

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000

六安瓜片為綠茶中的一種，研究表明，長期飲用該茶可以預(yù)防部分癌癥，治療心血管疾病，還具有減肥減脂、清熱降火等功效[1]。六安瓜片的外形尤為獨特，香高味醇，因此受到眾多消費者們的青睞[2]。六安瓜片茶的化學(xué)成分中無機礦質(zhì)元素含量較多，有機化合物如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、茶多酚、皂苷等則含量較少，具有一定的保健功能[3]。

乳酸菌是一類利用碳水化合物作為原料，發(fā)酵碳水化合物而產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱[4]。 研究證明，乳酸菌作為安全級菌株加入到食品中，能改善其營養(yǎng)價值和風(fēng)味，延長其保質(zhì)期，提高食品的商業(yè)價值[5]。茶飲料通常指的是將茶葉或者茶葉提取物進(jìn)行多種工藝加工而成的飲品，具有飲用方便、天然營養(yǎng)、衛(wèi)生安全、可口保健等特點[6]。隨著乳酸菌發(fā)酵的茶飲料在市場中陸續(xù)出現(xiàn)，有關(guān)的研究報道也逐漸增加。曹振輝[7]對乳酸菌發(fā)酵茶飲料的發(fā)酵工藝等進(jìn)行了研究。劉佳琦等[8]通過研究得出了利用乳酸菌發(fā)酵部分茶飲料的最佳操作條件，并且分析了發(fā)酵前后茶汁中的主要揮發(fā)性成分。

目前，關(guān)于乳酸菌發(fā)酵茶飲料的過程中發(fā)酵液抗氧化能力的變化規(guī)律的研究鮮有報道。本文以六安瓜片茶浸提液為基質(zhì)，分別接種不同濃度的乳酸菌菌懸液進(jìn)行發(fā)酵處理，檢測發(fā)酵過程中發(fā)酵液的超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基等自由基清除能力以及還原力等指標(biāo)，并分析發(fā)酵過程中茶汁發(fā)酵液抗氧化能力的具體變化規(guī)律，以期為后續(xù)發(fā)酵茶飲料的研發(fā)及功能性飲料的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實驗材料

六安瓜片茶，產(chǎn)于六安市御茗灣茶業(yè)有限公司，生產(chǎn)日期為2019年4月10日。

1.1.2 實驗菌株

植物乳桿菌7-1，宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.3 主要試劑及設(shè)備

本研究所用試劑主要有:由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的焦性沒食子酸、DPPH試劑、七水合硫酸亞鐵、六氰合鐵(III)酸鉀、六水合三氯化鐵、水楊酸等。實驗所用的主要儀器與設(shè)備見表1。

表1 主要儀器與設(shè)備

1.2 實驗方法

1.2.1 茶汁的制備

(1)浸提：料水比為0.5∶100、1.0∶100、1.5∶100，每種料水比都分別浸泡時長10 min、20 min、30 min。

(2)過濾：采用微孔膜過濾茶汁。

(3)殺菌：水浴90 ℃，殺菌10 min。

(4)優(yōu)化：選取無飲食偏好的10名體驗者組成實驗感官評定小組，對茶汁的風(fēng)味、色澤以及口感按照表3進(jìn)行感官評分，實驗重復(fù)3次進(jìn)行，總分為100分；感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 茶汁的感官評定表

1.2.2 乳酸菌懸液的制備

活化植物乳桿菌7-1，制備其菌懸液的具體方法參照張治錟的《抗生素藥品檢驗》中所述的方法[9]。

1.2.3 發(fā)酵過程中茶汁還原力的測定

將三種不同菌液添加量的六安瓜片茶汁分別稀釋10倍后各取1 mL加入到10 mL的離心管中，用文獻(xiàn)[10]的方法測定茶汁的還原力，用蒸餾水作為空白對照。按吸光度值與還原能力成正比測定茶葉還原力。

1.2.4 發(fā)酵過程中茶汁DPPH自由基清除能力的測定

把不同加菌量的樣品分別稀釋10倍再各取100 μL加入到試管中，具體實驗方法參考文獻(xiàn)[11]。自由基清除率的計算方法：

清除率/%= (Ab-AS)/Ab×100

其中,Ab為空白管的吸光度值;As為樣品管的吸光度值。

1.2.5 發(fā)酵過程中茶汁羥基自由基的清除能力的檢測

本實驗采用水楊酸法檢測羥自由基的清除效力[12]。在25 mL的試管中按順序加入9 mmol/L FeSO4,9 mmol/L水楊酸、適量的去離子水、8.8 mmol/L H2O2，得到混勻試劑，將混勻后的試劑再于37 ℃的恒溫水浴鍋中保存15～20 min，最后在510 nm波長處測吸光度值A(chǔ)0和Ax值，以不加H2O2的體系為A0測定時的參比溶液。Ax和Ax0測定時，以去離子水作為參照液。羥自由基的清除率的計算方法如下：

清除率/%=(A0+Ax0-Ax)/A0×100

1.2.6 發(fā)酵過程中茶汁超氧陰離子自由基清除能力的測定

本文采用鄰苯三酚自氧化法對茶汁發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基清除能力進(jìn)行測定，實驗方法按照文獻(xiàn)[13]。其中HCl的濃度為0.01 mol/L。自由基清除能力計算公式如下：

清除率/%= (對照的自氧化率-樣品的自氧化率)/對照的自氧化率×100

2 結(jié)果與分析

2.1 茶汁制備感官評定結(jié)果

經(jīng)感官評定小組對于茶汁的感官評分，茶汁的感官評定得分表如表3所示，結(jié)果顯示，料水比為1∶100，浸泡20 min為茶汁制備的最佳條件，并將此條件下制備的茶汁用于后續(xù)實驗。

表3 茶汁感官評定得分表

2.2 乳酸菌發(fā)酵過程中六安瓜片茶汁還原力的變化

抗氧化活性同還原力具有一定的相關(guān)性，現(xiàn)階段已被許多研究所證實[14]?？寡趸瘎┢渥陨砭哂幸欢ǖ倪€原作用因而能夠給出電子，自由基由于電子的存在而得到部分清除，實驗結(jié)果以還原能力來表示，還原力與六安瓜片茶汁發(fā)酵液的抗氧化性成正比關(guān)系。在本實驗中，六安瓜片茶汁中的抗氧化劑能夠使鐵氰化鉀中的三價鐵變成二價鐵，而二價鐵會與三氯化鐵繼續(xù)反應(yīng)，生成的物質(zhì)在700 nm波長處有最大吸光度值，所以吸光度值越大,則說明六安瓜片茶汁的還原能力越強。

六安瓜片茶汁發(fā)酵過程中還原力的變化情況可由圖1看出，三種不同加菌量的六安瓜片茶汁在整個發(fā)酵過程中均呈現(xiàn)為前36 h逐漸上升后緩慢降低的趨勢，但整個發(fā)酵過程中兩種加菌茶汁還原能力始終低于未加菌茶汁，說明在整個發(fā)酵過程中未加菌茶汁的還原力稍強于加菌茶汁。

圖1 乳酸菌發(fā)酵過程中還原力在六安瓜片茶汁中的改變

2.3 乳酸菌發(fā)酵過程中六安瓜片茶汁DPPH自由基清除能力的變化

DPPH乙醇溶液顯紫色，當(dāng)將抗氧化物質(zhì)加入到DPPH乙醇溶液中后，孤對電子被配對后，原先的紫色液體則會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色液體且吸光度在517 nm波長處逐漸減小，減小的程度與自由基的清除能力密切相關(guān)[15]。六安瓜片茶汁發(fā)酵的過程中其DPPH自由基清除能力的變化如圖2所示。

圖2 乳酸菌發(fā)酵過程中DPPH自由基在六安瓜片茶汁中的清除能力

從圖2可以看出，整個發(fā)酵過程中三種不同加菌量的六安瓜片茶汁的DPPH自由基清除能力總體變化不明顯，但未添加菌液的茶汁的DPPH自由基清除能力略高于其他兩種加菌茶汁。

2.4 乳酸菌發(fā)酵過程中六安瓜片茶汁羥自由基清除能力的變化

人體內(nèi)存在一種活性氧為羥自由基，該自由基氧化性較強，可能會造成人體內(nèi)許多病理變化，例如其較強的氧化性可能使生物體內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等會受到損傷，并且還可能會引起細(xì)胞代謝紊亂或者衰老死亡等現(xiàn)象。在整個發(fā)酵過程中，三種不同加菌量的六安瓜片茶汁在發(fā)酵前48 h內(nèi)其羥自由基清除能力均呈現(xiàn)上升趨勢且加菌前后變化不明顯，但48 h后三種六安瓜片茶汁自由基清除能力均呈現(xiàn)下降趨勢，但總體來看加菌茶汁自由基清除能力低于未加菌茶汁，且菌液添加量為1%的茶汁清除能力下降程度高于5%添加量的茶汁如圖3。結(jié)果表明，六安瓜片茶汁的羥自由基清除能力在乳酸菌的加入下無明顯變化。

圖3 乳酸菌發(fā)酵過程中羥自由基在六安瓜片茶汁中的清除能力

2.5 乳酸菌發(fā)酵過程中六安瓜片茶汁超氧陰離子自由基清除能力的變化

超氧陰離子屬于生物體在代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基，對脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子具有一定的破壞作用，它能夠使大分子物質(zhì)相互鏈接或者斷裂，從而可能會引起細(xì)胞受損，導(dǎo)致機體發(fā)生病變或者壞死。人體內(nèi)通常在正常情況下會存在一定數(shù)量的超氧陰離子，超氧陰離子在人體內(nèi)會與羥基發(fā)生結(jié)合然后會致使細(xì)胞DNA發(fā)生損傷，該結(jié)果會損害人體機能健康[16]。三種不同加菌量的六安瓜片茶汁在發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基清除能力的變化情況可由圖4看出，在茶汁發(fā)酵的前36 h，三種六安瓜片茶汁自由基清除能力急劇上升后趨于平穩(wěn)，但添加乳酸菌發(fā)酵的茶汁自由基清除能力始終低于未加菌茶汁，1%添加量的茶汁自由基清除能力低于5%添加量的茶汁。加菌茶汁的超氧陰離子自由基清除能力與未加菌的六安瓜片茶汁相比略低，但總體來看超氧陰離子自由基清除能力仍然保持較高水平。

圖4 乳酸菌發(fā)酵對六安瓜片茶汁超氧陰離子自由基清除能力的影響

3 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明，料水比為1∶100，浸泡20 min是六安瓜片茶汁制備的最佳條件。以該條件制備的六安瓜片茶汁作為培養(yǎng)基發(fā)酵乳酸菌，研究六安瓜片茶汁在60 h的發(fā)酵過程中其抗氧化活性的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在發(fā)酵的前36 h，三種不同的六安瓜片茶汁的還原力、超氧陰離子自由基清除能力均呈現(xiàn)先急劇上升后逐漸下降或者趨于平穩(wěn)的趨勢，且加入乳酸菌的六安瓜片茶汁還原力、超氧陰離子自由基清除能力均低于未加菌茶汁。在整個發(fā)酵過程中，三種不同加菌量的六安瓜片茶汁的羥自由基清除能力在發(fā)酵的前48 h先急劇上升，后逐漸穩(wěn)定，在48 h之前，三種不同加菌量的六安瓜片茶汁的羥自由基清除能力相差不大，但48 h后未加菌茶汁羥自由基清除能力還是略高于另外兩種加菌茶汁。

綜上可知，六安瓜片茶經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后其抗氧化活性有所降低但仍然保持較高水平，表明將乳酸菌加入茶汁這一工藝是可行的，不僅可以使茶汁具有乳酸菌特殊的營養(yǎng)功能，改善茶汁的風(fēng)味，提高茶汁的附加值，同時也不會對茶汁自身的抗氧化活性造成較大影響。因此本研究可為發(fā)酵茶飲料研制及功能性飲料的開發(fā)提供一定借鑒。