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      芪貞降糖顆粒對糖尿病腎病大鼠腎功能的改善作用研究

      2020-09-29 01:44:08周婭紅方朝暉何云嬌劉曉闖
      關(guān)鍵詞:降糖腎小球低劑量

      周婭紅, 方朝暉, 姜 輝, 何云嬌, 劉曉闖, 沈 悅

      (1安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部, 合肥 230031; 2安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院, 合肥 230012)

      糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是由高血糖誘發(fā)的糖尿病微血管并發(fā)癥,臨床表現(xiàn)為高血壓、蛋白尿、水腫等特征[1-2],其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,涉及炎癥感染、自身免疫、遺傳、環(huán)境因素、飲食習(xí)慣等諸多因素[3-4]。DN的發(fā)病率約占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的20%~40%,患者發(fā)展到終末期會(huì)引起腎小球硬化癥,引發(fā)腎功能衰竭[5-6]。目前臨床上多以控制患者血糖、血壓、飲食干預(yù)及腎臟替代療法等治療手段[7-8]。芪貞降糖顆粒為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療糖尿病的特色醫(yī)院制劑,由黃芪、女貞子、山茱萸、黃連、五倍子等組成,臨床應(yīng)用多年,療效明確[9-10],具有降糖調(diào)脂,治療2型糖尿病(T2DM)的作用。本研究采用DN大鼠為模型探究芪貞降糖顆粒對DN的治療作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

      1 材料與方法

      1.1 儀器AUUC-CHEK型血糖儀(上海羅氏有限公司);D3024R型高速冷凍型微量離心機(jī)(美國DragonLab公司);ZT-12M型全密封自動(dòng)脫水機(jī)(湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司),YB-7LF型組織包埋機(jī)(湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);H-7650型 日立透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

      1.2 試藥芪貞降糖顆粒(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房自制,批號:20180621);二甲雙胍片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司,批號:67190605);鏈脲佐菌素(美國 Sigma公司,批號:SLBB8126V);PBS緩沖液(美國Zsbio公司,批號:18070201);SCr檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20190318);BUN檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20190324)。

      1.3 動(dòng)物清潔級雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,共60只,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號:SCXK(皖)2011-002。

      2 方法

      2.1 動(dòng)物模型的建立將60只SD大鼠正常飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)取10只給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng),剩余50只大鼠給予高酯飼料喂養(yǎng),飼養(yǎng)4周后,禁食12 h,高酯飼養(yǎng)大鼠按35 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射0.1 mol/L STZ溶液,基礎(chǔ)飼養(yǎng)大鼠注射等量的檸檬酸緩沖溶液。1周后測大鼠尾靜脈空腹血糖,血糖值≥16.7 mmol/L為DN的成模標(biāo)準(zhǔn)[11-12]。

      2.2 分組及給藥方法將成模的50只大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組(二甲雙胍180 mg/kg體質(zhì)量)、芪貞降糖顆粒低、中、高劑量組(芪貞降糖顆粒50、100、200 mg/kg體質(zhì)量),每組10只。10只未建模大鼠為正常組,模型組和正常組大鼠灌服等體積純化水,各組大鼠連續(xù)給藥8周。

      2.3 指標(biāo)的測定

      2.3.1 體質(zhì)量的測定 稱量各組大鼠給藥后0、4、8周的體質(zhì)量值。

      2.3.2 空腹血糖(FBG)的測定 采用尾靜脈消毒后針刺取血,測定各組大鼠建模成功后0、4、8周的FBG值。

      2.3.3 血脂TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前大鼠禁食12 h,腹腔注射3.5%水合氯醛溶液麻醉處理,腹主動(dòng)脈取血,分離血清,紫外分光光度法測定血脂含量。

      2.3.4 血清SCr和BUN含量的測定 吸取各組大鼠血清適量,按試劑盒說明書操作,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清SCr和BUN含量。

      2.3.5 腎組織IL-1、IL-6和TNF-α含量的測定 取各組大鼠腎組織,用預(yù)冷的PBS溶液沖洗后破碎處理,均漿后分離得到上清,采用酶聯(lián)免疫吸附法測定IL-1、IL-6和TNF-α含量。

      2.3.6 腎組織病理學(xué)的改變 取各組大鼠腎皮質(zhì)適量,固定,常規(guī)脫水,包埋,制備石蠟切片,HE染色觀察腎組織病理改變。

      2.3.7 腎足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變 將腎皮質(zhì)固定在4%的戊二醛溶液中,PBS緩沖液沖洗后,用丙酮處理液脫水,環(huán)氧樹脂包埋,切成50 nm厚度的薄片,用透射電鏡觀察腎小球基底膜厚度和足細(xì)胞的變化情況。

      3 結(jié)果

      3.1 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量的比較各組大鼠給藥前體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較,二甲雙胍組、芪貞降糖顆粒各劑量組大鼠給藥后體質(zhì)量均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與二甲雙胍組給藥后相比,芪貞降糖顆粒各劑量組大鼠給藥后體質(zhì)量均無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

      3.2 各組大鼠給藥前后FBG含量的比較各組大鼠給藥前FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比,二甲雙胍組、芪貞降糖顆粒組高、中劑量組給藥后大鼠FBG均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與二甲雙胍組給藥后相比,芪貞降糖顆低劑量組給藥后大鼠FBG均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表2。

      表1 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量的比較

      表2 各組大鼠給藥前后FBG含量的比較

      3.3 各組大鼠給藥后血脂含量的比較與模型組相比,二甲雙胍組、芪貞降糖顆粒組高、中、低劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C含量均降低,HDL-C含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見表3。

      3.4 各組大鼠給藥后血清SCr和BUN含量的比較與模型組相比,二甲雙胍組、芪貞降糖顆粒組高、中、低劑量組大鼠血清SCr和BUN含量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與二甲雙胍組相比,芪貞降糖顆粒低、中劑量組大鼠血清SCr和BUN含量均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見表4。

      3.5 各組大鼠給藥后腎組織IL-1、IL-6和TNF-α含量的比較與模型組相比,二甲雙胍組和芪貞降糖顆粒高、中、低劑量組大鼠腎組織IL-1、IL-6和TNF-α含量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與二甲雙胍組相比,芪貞降糖顆粒低、中劑量組大鼠腎組織IL-1、IL-6和TNF-α含量均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見表5。

      3.6 各組大鼠腎組織病理學(xué)的改變情況正常組腎小球結(jié)構(gòu)完整,腎小管結(jié)構(gòu)清晰,基底膜基質(zhì)未現(xiàn)異常變化;模型組腎小球細(xì)胞排列紊亂,體積變小,腎小管細(xì)胞存在空泡化和基底膜增厚現(xiàn)象。芪貞降糖顆粒高、中、低劑量組腎小球細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整,排列較規(guī)則,腎小球基底膜增生現(xiàn)象較模型組有所改善,見圖1。

      3.7 各組大鼠腎小球足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變情況正常組腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,足突間無沉淀物聚集。模型組腎小球足細(xì)胞基底膜存在增生,伴隨有致密物聚集,足細(xì)胞排列紊亂,出現(xiàn)空泡化。芪貞降糖顆粒高、中、低劑量組腎小球足細(xì)胞基底膜增厚現(xiàn)象較模型組有所減輕,足細(xì)胞排列較整齊,細(xì)胞內(nèi)有少許基質(zhì)損傷,存在輕微融合現(xiàn)象,見圖2。

      表3 各組大鼠給藥后血脂含量的比較

      表4 各組大鼠給藥后血清SCr和BUN含量的比較

      表5 各組大鼠IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)

      A: 正常組

      B:模型組

      C: 二甲雙胍組

      D:芪貞降糖顆粒低劑量組

      E:芪貞降糖顆粒中劑量組

      F:芪貞降糖顆粒高劑量組

      A: 正常組

      B:模型組

      C: 二甲雙胍組

      D:芪貞降糖顆粒低劑量組

      E:芪貞降糖顆粒中劑量組

      F:芪貞降糖顆粒高劑量組

      4 討論

      STZ腹腔注射結(jié)合高脂飲食誘導(dǎo)是現(xiàn)階段制備DN模型的常用方法,該法簡單易行,模型特征穩(wěn)定,與人類早期DN的發(fā)病指征相似,是研究DN及微血管并發(fā)癥的的理想模型[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠體質(zhì)量降低,F(xiàn)BG、血脂水平高于正常組大鼠,表明DN模型具有高血糖、高血脂的特征,同時(shí)伴隨體重降低現(xiàn)象,此結(jié)果與文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道一致。當(dāng)腎組織出現(xiàn)損傷時(shí),腎小球通透性隨之增加,濾過率繼而降低,由此引發(fā)血清中SCr和BUN的濃度升高。由本研究結(jié)果可知,與模型組相比,芪貞降糖顆粒組大鼠SCr和BUN存在不同程度的降低,證實(shí)芪貞降糖顆粒具有提高腎小球?yàn)V過率,減輕腎損傷的作用,同時(shí)能夠降低腎臟炎性因子釋放,降低細(xì)胞膜及細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。結(jié)合腎組織病理形態(tài)學(xué)和電鏡觀察發(fā)現(xiàn),模型組因持續(xù)高血糖和炎性浸潤,大鼠腎組織損傷較明顯,腎小球出現(xiàn)明顯萎縮現(xiàn)象,進(jìn)一步加重了腎小球硬化癥及腎衰的發(fā)生率。經(jīng)芪貞降糖顆粒治療后,在一定程度上延緩了大鼠腎小球細(xì)胞的形態(tài)改變,減輕了基底膜的增厚及間質(zhì)纖維化現(xiàn)象的發(fā)生,同時(shí)也促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)穩(wěn)定,提高腎小球細(xì)胞的濾過功能,減輕腎組織纖維化的影響,起到對腎功能的保護(hù)作用。綜上所述,芪貞降糖顆粒能夠降低DN大鼠FBG、血脂含量、血清SCr和BUN含量以及炎性因子表達(dá),其作用機(jī)制與增加腎組織細(xì)胞穩(wěn)定,改善腎小球基底膜厚度和纖維化程度有關(guān)。

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