T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)封堵效應(yīng)的生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

王若崢, 范佩文

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療中心， 烏魯木齊 830011； 2新疆腫瘤學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011；13中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤免疫與放療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011)

近年來(lái)，免疫療法作為腫瘤治療的一大突破受到越來(lái)越多的關(guān)注。腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要機(jī)制之一是T細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)受體(immune checkpoint receptor, ICR)表達(dá)的重編程[1]。ICRs是一類共刺激因子(CD27、CD28和CD137)和共抑制受體(如PD-1、CTLA-4、LAG-3等)，它們共同調(diào)節(jié)T細(xì)胞的反應(yīng)質(zhì)量。目前應(yīng)用最廣泛的免疫檢查點(diǎn)阻斷(immune checkpoint blockade, ICB)治療策略是靶向PD-1/PD-L1和CTLA-4信號(hào)通路，以調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫活性，并顯示出一定的臨床療效[2]。

ICB對(duì)多種免疫原性強(qiáng)的惡性腫瘤有效。美國(guó)食品藥物管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)已批準(zhǔn)將ICB藥物用于黑色素瘤，NSCLC，腎細(xì)胞癌，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，霍奇金淋巴瘤，尿路上皮癌，胃癌，宮頸癌等的臨床治療[3]。雖然相當(dāng)一部分患者表現(xiàn)出客觀的臨床反應(yīng)，但由于原發(fā)性或獲得性耐藥，大多數(shù)患者對(duì)ICB治療反應(yīng)不佳。迄今為止，治療效果最差的是抗CTLA-4，約85%的患者無(wú)反應(yīng)[4]，其次是抗PD-1，反應(yīng)約40%[5]。聯(lián)合治療方案的反應(yīng)率較高(約50%)，但毒性也較高[6]。因此，迫切需要預(yù)測(cè)ICB反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

1 誘導(dǎo)抑制性免疫檢查點(diǎn)(ICs)是腫瘤免疫逃逸的主要機(jī)制

免疫編輯假說(shuō)概念化了腫瘤細(xì)胞在免疫壓力下向腫瘤擴(kuò)散和免疫監(jiān)視逃逸的進(jìn)化過(guò)程。有幾個(gè)因素促成了這種免疫逃避。腫瘤微環(huán)境(TME)本身具有免疫抑制作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞因子、趨化因子和抑制因子的進(jìn)展[7]。例如，VEGFA可以上調(diào)CD8 + T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，而TGF-β增強(qiáng)PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)[8-9]。此外，TME還可以招募免疫抑制免疫細(xì)胞，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等來(lái)逃避免疫清除。在免疫攻擊的壓力下，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)減少基因表達(dá)或丟失突變等位基因來(lái)減少T細(xì)胞識(shí)別的新抗原的數(shù)量[10]。

在腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生的免疫抑制的主要機(jī)制之一是多種共抑制性受體(ICR)的上調(diào)，這些受體在腫瘤-基質(zhì)界面以及基質(zhì)本身內(nèi)部產(chǎn)生一系列相互作用，導(dǎo)致阻斷免疫攻擊和T細(xì)胞耗竭。T細(xì)胞耗竭的關(guān)鍵標(biāo)志是ICR的表達(dá)，導(dǎo)致效應(yīng)功能喪失和無(wú)法轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃汿細(xì)胞池。T細(xì)胞耗竭在各種腫瘤中的重要性與慢性感染期間發(fā)生的耗竭相似。慢性抗原刺激可觸發(fā)多種高水平抑制受體的共表達(dá)，包括PD-1、CTLA-4和T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白域-3 (TIM-3)等[11]。其中PD-1/PD-L1信號(hào)軸在免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)控中起主導(dǎo)作用，而CTLA-4與PD-1一樣通過(guò)阻斷T細(xì)胞激活的共刺激來(lái)建立免疫抑制相互作用，維持外周免疫耐受。鑒于PD-1 / PD-L1和CTLA-4途徑在腫瘤免疫逃逸中的重要作用，抗PD-1 / PD-L1和抗CTLA-藥物及其組合已成為當(dāng)前主流的ICB腫瘤免疫療法。

2 臨床靶向ICR信號(hào)通路的機(jī)制

PD-1廣泛表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[12]。PD-1通常被認(rèn)為是顯性的抑制性ICR。與CTLA-4不同，PD-1信號(hào)通路的激活主要發(fā)生在適應(yīng)性免疫抑制級(jí)聯(lián)的效應(yīng)階段，阻斷了細(xì)胞毒性T細(xì)胞清除癌細(xì)胞的能力。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞中PD-1與腫瘤細(xì)胞中PD-L1之間的相互作用通過(guò)多種機(jī)制降低了T細(xì)胞的活性，包括抑制T細(xì)胞受體下游信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增強(qiáng)、B細(xì)胞的減少和自然殺傷細(xì)胞活性的降低[13-14]。PD-1與PD-L1的結(jié)合還阻斷了CD28和T細(xì)胞受體(TCR)信號(hào)的激活以及T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)的接觸[15-16]。在與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞中，PD-1的高表達(dá)水平會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬的減少。其配體PD-L1在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)導(dǎo)致Teff細(xì)胞溶解抗性，降低了顆粒酶A和穿孔蛋白的轉(zhuǎn)錄水平[17]。此外，PD-1信號(hào)通過(guò)穩(wěn)定免疫突觸形成，使CD4+和CD8+ T細(xì)胞在衰竭過(guò)程中喪失運(yùn)動(dòng)能力[18]。PD-1信號(hào)在腫瘤免疫中的相關(guān)性可以通過(guò)CD8+ T細(xì)胞中的PD-1表達(dá)作為晚期黑色素瘤和宮頸癌患者腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞亞群的生物標(biāo)志物得到證實(shí)[19-20]。 另一個(gè)重要的ICR是CTLA-4，它通過(guò)與共刺激受體CD28競(jìng)爭(zhēng)來(lái)削弱T細(xì)胞的活化，導(dǎo)致IL-2，IL-4，TNF-α和IFN-γ的水平降低，以及CD8+和CD4+T細(xì)胞的增殖減少。與PD-1的廣泛表達(dá)相反，CTLA-4主要在Treg細(xì)胞上表達(dá)并控制免疫自耐受和Treg誘導(dǎo)的免疫抑制[21]。CTLA-4通過(guò)排除DC與傳統(tǒng)T細(xì)胞(Tconv)的Treg物理附著，抑制DC上CD86/80的表達(dá)并削弱抗原啟動(dòng)初始T細(xì)胞活化[22]。另外，在抗原暴露下，CTLA-4+CD4 +T細(xì)胞與DC的相互作用比CTLA-4-CD4+T細(xì)胞更短，從而導(dǎo)致IL-2水平和增殖降低[23]。此外，CTLA-4阻斷可拯救TH1類CD4效應(yīng)T細(xì)胞，并且可能與CD8 T細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞溶解活性的增強(qiáng)以及記憶性T細(xì)胞的形成有關(guān)[24]。

3 候選ICB反應(yīng)性生物標(biāo)志物

盡管對(duì)免疫檢查點(diǎn)的認(rèn)識(shí)和特異性免疫檢查點(diǎn)抑制劑的開發(fā)取得了重大進(jìn)展，但許多免疫原性腫瘤患者對(duì)ICB不敏感，同時(shí)嚴(yán)重的不良反應(yīng)和高昂的治療成本也使得對(duì)ICB應(yīng)答者的識(shí)別和生物標(biāo)志物的研究成為迫切需要。將治療前獲得的靜態(tài)生物標(biāo)志物與用于監(jiān)測(cè)和進(jìn)一步臨床分層的動(dòng)態(tài)生物標(biāo)志物相結(jié)合，有望納入ICB治療方案。目前，ICB的應(yīng)答性生物標(biāo)志物候選已在不同的生物學(xué)水平(細(xì)胞、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄本、基因)、不同的部位(腫瘤、外周血)，以及與免疫和腫瘤相關(guān)細(xì)胞群上被發(fā)現(xiàn)[25]，生物學(xué)相關(guān)的臨床生物標(biāo)志物可能有助于預(yù)測(cè)ICB反應(yīng)。

3.1 遺傳和表觀遺傳標(biāo)志物在抗PD-1和抗CTLA-4單藥治療的背景下，多項(xiàng)研究探討了NSCLC和黑色素瘤中整體腫瘤突變負(fù)荷/新抗原負(fù)荷與ICB反應(yīng)之間的關(guān)系[26-28]?；蛑械奶囟ㄟz傳突變，例如JAK1 / 2和BRCA1/2，可以預(yù)測(cè)ICB的臨床療效，這可能是由于未能激活I(lǐng)FN-γ靶基因和DNA修復(fù)機(jī)制缺陷的腫瘤中突變負(fù)荷增加所致[29-31]。JAK家族成員的功能喪失突變使黑素瘤對(duì)IFN-γ刺激具有抵抗力，而對(duì)IFN-γ觸發(fā)的生長(zhǎng)停滯不敏感[29]，并可能下調(diào)PD-L1表達(dá)，這是對(duì)PD-1封鎖脫敏的可能機(jī)制[30]。DNA雙鏈修復(fù)酶BRCA2中的突變導(dǎo)致突變負(fù)擔(dān)急劇增加，導(dǎo)致對(duì)PD-1阻斷的反應(yīng)性增強(qiáng)[26]。此外，在對(duì)CTLA-4和PD-L1阻斷有反應(yīng)的黑色素瘤患者中，IFN-γ誘導(dǎo)的IDO表達(dá)增加[32]。此外，在對(duì)PD-1阻滯的應(yīng)答者中觀察到通過(guò)TCR的β鏈測(cè)序鑒定出的更高的TCR克隆性[33]。

越來(lái)越多的證據(jù)表明表觀遺傳標(biāo)記在致癌作用中的重要作用[34-35]。真核生物常見的DNA甲基化類型為5-胞嘧啶甲基化(5mC)。而5mC在TET家族酶氧化后產(chǎn)生5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)，5hmC被稱為"第六種堿基"，可以調(diào)控基因表達(dá)，是一種重要的表觀遺傳修飾。研究表明5mC對(duì)于調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖并維持細(xì)胞毒性和輔助T細(xì)胞的分化至關(guān)重要，在抗原呈遞后5hmC沉積在關(guān)鍵免疫基因中對(duì)T淋巴細(xì)胞的活化和分化具有特定作用，而5hmC的變化比5mC的變化更動(dòng)態(tài)[36]。例如肝癌細(xì)胞顯示出特定的甲基化和羥甲基化組譜，表明這些表觀遺傳標(biāo)記有可能用作診斷或預(yù)后生物標(biāo)記[37]。

3.2 轉(zhuǎn)錄生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄特征也可以提供對(duì)PD-1阻斷反應(yīng)的信息，尤其是當(dāng)DNA突變特征和免疫學(xué)特征相似時(shí)。ICB后與臨床結(jié)果相關(guān)的其他特征引入了新的假定的耐藥機(jī)制，例如層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的作用，這可能會(huì)形成屏障，使免疫細(xì)胞無(wú)法穿透腫瘤從而削弱免疫療法[38]。另外，內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ERV)RNA的表達(dá)與抗CTLA-4和PD-L1治療的臨床反應(yīng)相關(guān)[39]。

3.3 組織病理學(xué)生物標(biāo)志物在蛋白質(zhì)水平上，組織病理學(xué)生物標(biāo)志物包括PD-L1表達(dá)，PD-L1表達(dá)是黑色素瘤，NSCLC，腎細(xì)胞癌(RCC)和膀胱癌背景下抗PD-1和PD-L1單藥治療期間的生物標(biāo)志物候選物[40]。迄今為止，PD-L1是FDA批準(zhǔn)的唯一藥物ICB生物標(biāo)志物，用于pembrolizumab(抗PD-1)治療NSCLC，胃或胃食管交界處腺癌，宮頸癌和尿路上皮癌。

3.4 細(xì)胞生物標(biāo)志物腫瘤內(nèi)的免疫細(xì)胞全景圖區(qū)分了CTLA-4和PD-1阻斷的臨床反應(yīng)和耐藥性。一方面，在腫瘤浸潤(rùn)的CD8+ T細(xì)胞中，PD-1+CTLA4+T細(xì)胞中CD8+ T細(xì)胞的特定群體的存在與無(wú)進(jìn)展生存(PFS)相關(guān)。這些細(xì)胞代表腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞具有部分耗竭表型，它們更容易通過(guò)阻斷共抑制受體的相互作用而恢復(fù)活力。另一方面，單純挽救CD8+ T細(xì)胞不一定與臨床反應(yīng)相關(guān)。然而，當(dāng)涉及到腫瘤負(fù)荷時(shí)，循環(huán)中的復(fù)活的PD-1+Ki67+CD8+ T細(xì)胞比單獨(dú)的復(fù)活細(xì)胞計(jì)數(shù)更能預(yù)測(cè)PD-1阻斷后的PFS[41]。此外，CD8+ T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例與CTLA-4阻斷的黑色素瘤的腫瘤壞死呈線性相關(guān)[42]。

3.5 液體活檢生物標(biāo)志物循環(huán)成分在識(shí)別反應(yīng)性生物標(biāo)志物方面有很大的潛力，可以在體液中進(jìn)行非侵入性和動(dòng)態(tài)的檢測(cè)。到目前為止，循環(huán)游離DNA (cfDNA)的檢測(cè)為多種腫瘤治療策略提供了臨床指導(dǎo)[43]。cfDNA中發(fā)現(xiàn)的突變是腫瘤活檢的可靠替代物，治療后cfDNA水平的升高可能與黑色素瘤患者的進(jìn)展性疾病有關(guān)。cfDNA水平在其臨床表現(xiàn)之前就能提供反應(yīng)信息，并能預(yù)測(cè)ICB治療的黑色素瘤患者的腫瘤負(fù)荷[44]。cfDNA中定量的拷貝數(shù)不穩(wěn)定性可以預(yù)測(cè)疾病的進(jìn)展，在免疫治療不同腫瘤的患者中，其總體準(zhǔn)確性優(yōu)于單獨(dú)的cfDNA濃度[45]。

最近的幾項(xiàng)研究也表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)的檢測(cè)和定量可以被認(rèn)為是ICB中一個(gè)有前途的候選循環(huán)生物標(biāo)志物。最近發(fā)表的一份病例報(bào)告將外周血中CTCs的檢測(cè)與轉(zhuǎn)移過(guò)程聯(lián)系起來(lái)，PD-L1在晚期頭頸癌患者的CTCs中高表達(dá)，提示PD-L1+ CTCs可以作為預(yù)測(cè)ICB反應(yīng)的生物標(biāo)志物[46]。屬于ICR途徑的蛋白也在液體活檢中被檢測(cè)到，并與反應(yīng)相關(guān)ICB治療前可溶性PD-L1水平較高的患者更容易進(jìn)展，治療后PD-L1水平的升高與ICB的部分應(yīng)答相關(guān)[47]。共抑制性T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白3 (TIM3)、PD-1、IL-15與CTLA-4阻斷后較長(zhǎng)生存期呈負(fù)相關(guān)，其中IL-15增加了TIM3、PD-1的表達(dá)[48]。

4 展望

免疫檢查點(diǎn)封堵治療通過(guò)與共抑制性免疫受體競(jìng)爭(zhēng)的抗體重新激活抗腫瘤免疫反應(yīng)，是腫瘤免疫編輯和逃避免疫監(jiān)測(cè)的致命弱點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中也顯示出一定療效。然而，由于缺乏良好的反應(yīng)性生物標(biāo)志物和影響ICB療效的TME相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，很大一部分患者出現(xiàn)了先天性和獲得性耐藥，一些患者甚至出現(xiàn)了進(jìn)展性耐藥。正如我們?cè)谶@篇綜述中所描述的那樣，許多研究都致力于尋找識(shí)別能夠預(yù)測(cè)ICB反應(yīng)的生物標(biāo)志物。因此，使用新的方法以發(fā)現(xiàn)新的腫瘤內(nèi)在和外在的機(jī)制，并尋找可靠有效的ICB療效生物標(biāo)志物，為免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療療效的提高，毒性反應(yīng)的降低，從而為進(jìn)一步提供個(gè)性化腫瘤免疫治療策略具有重要意義。