鄧時(shí)銘, 劉 麗, 褚武英, 李躍輝, 王江偉, 陳圓華

(1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410153；2.長(zhǎng)沙學(xué)院生物工程與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410003；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

中華鱉(Peodiscussinensis)蛋白質(zhì)含量高，營(yíng)養(yǎng)豐富、全面，又可入藥，是老百姓喜愛(ài)的水產(chǎn)品食物，也是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動(dòng)物[1].但隨著中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，各類疾病頻繁發(fā)生，如紅脖子病、穿孔病、疥瘡病、腐皮病等，給養(yǎng)殖戶造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，也給我國(guó)中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展帶來(lái)了巨大阻力.中華鱉疥瘡病(病變后期又叫穿孔病[2])病原種類較多，有嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌和普通變形桿菌等，存在單獨(dú)感染、混合感染或繼發(fā)感染，發(fā)病率可達(dá)到10%～50%，死亡率可達(dá)30%～40%[3-6].2018年6—10月，湖南漢壽某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的幼鱉出現(xiàn)疥瘡病理特征，其運(yùn)動(dòng)遲緩，不攝食，背甲和腹甲部出現(xiàn)黃豆大小的白點(diǎn)并逐步擴(kuò)大，白點(diǎn)內(nèi)容物呈豆腐渣樣，腸道無(wú)食物，肝臟有白點(diǎn)，呈花肝狀，死亡率達(dá)100%.在排除寄生蟲和病毒感染后，本試驗(yàn)對(duì)臨死幼鱉疥瘡病原菌進(jìn)行分離，并采用人工感染回歸試驗(yàn)驗(yàn)證病原菌致病性，通過(guò)16S rDNA基因和生理生化指標(biāo)確定病原菌種類，通過(guò)病理組織切片觀察機(jī)體的病理變化,并通過(guò)體外藥物敏感性試驗(yàn)篩選防控藥物，以期為中華鱉疥瘡病的診斷與防控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病幼鱉來(lái)源于湖南省漢壽縣，單只質(zhì)量約為100 g；健康幼鱉來(lái)源于湖南省水產(chǎn)原種場(chǎng)，單只質(zhì)量約為120 g，體質(zhì)健壯，外表無(wú)損傷.

1.2 病原菌的分離與純化

無(wú)菌條件下，取體表病灶、肝臟、腸道內(nèi)容物劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，再挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落28 ℃純化培養(yǎng)18～24 h，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.3 分離菌形態(tài)鑒定

將分離菌分別接種于瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色和生理生化試驗(yàn)，結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]、《Bergey′s manual of determinative bacteriology》[8]、《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[9]和VITEK2-compact鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定.

1.4 分離菌16S rDNA序列分析

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明方法提取分離菌株總DNA，以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，釆用DNA純化回收試劑盒純化回收16S rDNA產(chǎn)物，然后由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序.將所得16S rDNA序列在NCBI的GenBank/Blast中進(jìn)行同源性比對(duì)分析；通過(guò)ClustalW、DNAstar和Mega 4等軟件，采用鄰接法(neighbour-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 人工感染試驗(yàn)

試驗(yàn)在室內(nèi)進(jìn)行.將健康幼鱉置于盛有自來(lái)水的小塑料桶中(自來(lái)水連續(xù)充氣，水溫保持28～30 ℃)，暫養(yǎng)7 d后開展人工感染試驗(yàn)，分設(shè)試驗(yàn)組6組和對(duì)照組1組，每組10只.將分離菌Lb18-01和Lb18-02在28 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h后，用無(wú)菌生理鹽水沖洗，分別配制成1.0×108、5.0×108、1.0×109cfu·mL-1細(xì)菌懸濁液，共6個(gè)濃度組.從幼鱉后肢窩注射0.1 mL菌液，對(duì)照組注射等量生理鹽水.試驗(yàn)期間適量投喂，連續(xù)觀察15 d，記錄幼鱉發(fā)病情況，對(duì)瀕死病鱉進(jìn)行解剖及病原菌分離與鑒定.

1.6 致病菌的藥物敏感性試驗(yàn)

采用紙片法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)[7]，每種藥敏片(直徑6 mm)重復(fù)5次.按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部制定的紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T125)判斷試驗(yàn)結(jié)果.供試藥物和含藥量見表1.

表1 藥敏片種類

1.7 內(nèi)臟病理組織觀察

無(wú)菌條件下，取健康中華鱉和患病中華鱉的肝臟、脾臟、腎臟和腸道組織制作常規(guī)病理切片，Olympus光學(xué)顯微鏡下拍照、觀察，比較分析患病中華鱉組織結(jié)構(gòu)的病理變化.

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌的形態(tài)特征

從患病中華鱉的體表病灶、腸道分離獲得優(yōu)勢(shì)純化菌1株，命名為L(zhǎng)b18-01；從肝臟分離獲得優(yōu)勢(shì)純化菌1株，命名為L(zhǎng)b18-02.將2株菌分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，分離菌Lb18-01在培養(yǎng)基上呈擴(kuò)散生長(zhǎng)，布滿培養(yǎng)基表面，似云霧狀，有腐敗味；分離菌Lb18-02在培養(yǎng)基上形成圓形或橢圓形、淡黃色、半透明的菌落，表面濕潤(rùn)、光滑，無(wú)腐敗味.分離菌Lb18-01革蘭氏染色呈陰性，紫紅色，桿狀或絲狀，長(zhǎng)短不一(圖1A)；分離菌Lb18-02革蘭氏染色也呈陰性，紫紅色，短桿狀，兩端鈍圓(圖1B).

2.2 分離菌的生理生化特性

試驗(yàn)表明，分離菌Lb18-01能分解葡萄糖、麥芽糖，有遷徙運(yùn)動(dòng)；分離菌Lb18-02不發(fā)酵鼠李糖、麥芽糖，接觸酶陽(yáng)性，無(wú)運(yùn)動(dòng)性(表2).結(jié)合文獻(xiàn)[7-9]以及VITEK2-compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)分析結(jié)果，初步認(rèn)為分離菌Lb18-01為普通變形桿菌，分離菌Lb18-02為腦膜膿毒性黃桿菌.

表2 分離菌的生理生化特性1)

2.3 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

按照試劑盒方法提取分離菌Lb18-01和Lb18-02的基因組總DNA，純化回收后測(cè)得序列長(zhǎng)度為1 416和1 387 bp，其GenBank登錄號(hào)為MN685224和MN685235.通過(guò)NCBI中Blast在線比對(duì)分析，2株菌16S rDNA序列與GenBank庫(kù)中的序列均有較高的相似性(98%～100%).系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2～3)顯示，分離菌Lb18-01的16S rDNA基因與Proteusvulgaris聚為一簇，分離菌Lb18-02的16S rDNA基因與Chryseobacteriummeningosepticum聚為一簇.由此進(jìn)一步確定分離菌Lb18-01和Lb18-02分別為普通變形桿菌(Proteusvulgaris)和腦膜膿毒性黃桿菌(Chryseobacteriummeningosepticum).

2.4 分離菌的人工感染試驗(yàn)結(jié)果

健康中華鱉注射分離菌Lb18-01和Lb18-02菌液后，第2天開始行動(dòng)呆滯，食欲下降，并陸續(xù)出現(xiàn)死亡，死亡率隨菌液濃度的增大而增加.第15天，1.0×109cfu·mL-1Lb18-01試驗(yàn)組死亡率達(dá)到70%，瀕死中華鱉背、腹部先出現(xiàn)紅斑點(diǎn)，后變白并逐漸膿性潰變；1.0×109cfu·mL-1Lb18-02試驗(yàn)組死亡率達(dá)到100%(表3)，病死中華鱉背、腹部無(wú)紅斑點(diǎn).經(jīng)過(guò)解剖可見，Lb18-01和Lb18-02試驗(yàn)組中華鱉的肝臟和膽囊微腫大，腸道紅腫，無(wú)食物，與自然發(fā)病癥狀相同；對(duì)照組未出現(xiàn)異常癥狀.這表明分離菌Lb18-01和Lb18-02均有較強(qiáng)的致病性.取人工誘發(fā)感染的中華鱉，再次進(jìn)行病原菌分離，獲得了與Lb18-01和Lb18-02形態(tài)、生理生化特性一致的菌株，表明分離菌Lb18-01和Lb18-02為中華鱉疥瘡的病原菌.

表3 健康幼鱉注射不同濃度菌液后的死亡率

2.5 分離菌的藥物敏感性

試驗(yàn)結(jié)果顯示，青霉素、氨芐西林、四環(huán)素等20種抗生素藥敏片(表1)周圍均無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，說(shuō)明這20種抗生素藥物對(duì)分離菌Lb18-01和Lb18-02無(wú)任何抑制或殺滅作用.

2.6 病理組織觀察

中華鱉患病后，其肝、脾、腎和腸道組織呈現(xiàn)不同的病理特征.動(dòng)脈管壁增粗，血管周圍炎癥細(xì)胞增多(圖4A箭頭1)；靜脈血管破裂(圖4A箭頭2)，竇狀隙擴(kuò)張，淤積大量紅細(xì)胞(圖4B箭頭1)；肝細(xì)胞界限模糊(圖4B箭頭2)，可見大量含鐵血黃素沉著(圖4B箭頭3).脾臟被膜增厚，被膜血管擴(kuò)張，內(nèi)有大量紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(圖4D)；紅髓區(qū)擴(kuò)大，可見大量紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和含鐵血黃素沉著(圖4E箭頭1、2、3)；大量淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，嚴(yán)重者破裂、解體，白髓區(qū)相對(duì)縮小，淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯減少，毛細(xì)血管擴(kuò)張，淤積紅細(xì)胞(圖4E箭頭4).

腎臟外側(cè)區(qū)和內(nèi)側(cè)區(qū)均滲入大量炎癥細(xì)胞，內(nèi)側(cè)區(qū)較外側(cè)區(qū)病變嚴(yán)重；腎小管上皮細(xì)胞及胞核腫大，發(fā)生顆粒變性，細(xì)胞游離面微絨毛不明顯，管腔變小或消失，腎小管間界限消失，成為合包體(圖4G箭頭2)；腎小球內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張，淤積大量血細(xì)胞(圖4G箭頭1)，部分腎小球出現(xiàn)壞死、解體(圖4H).腸道黏膜層上皮細(xì)胞排列紊亂(圖4J箭頭1)、密集，杯狀細(xì)胞顏色變深，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4J箭頭3)；固有層毛細(xì)血管擴(kuò)張，淤滯大量紅細(xì)胞，黏膜肌層淋巴細(xì)胞驟增(圖4J箭頭2)；黏膜下層和肌肉層血管腫脹，大量血細(xì)胞淤積其中(圖4K).

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌Lb18-01和Lb18-02均為中華鱉疥瘡病原菌，其致死率達(dá)70%以上.結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將分離菌Lb18-01和Lb18-02確定為普通變形桿菌(Proteusvulgaris)和腦膜膿毒性黃桿菌(Chryseobacteriummeningosepticum).

普通變形桿菌和腦膜膿毒性黃桿菌廣泛分布于自然界，是人和水產(chǎn)動(dòng)物的條件致病菌[10-14]，也是人、畜、魚共患重要病原[11,15].普通變形桿菌可引起傷口感染而出現(xiàn)疥瘡[15]，也可造成中華鱉穿孔病和白板病[3]；腦膜膿毒性黃桿菌可引起疾病暴發(fā)，致死率高，水生動(dòng)物中僅見牛蛙的相關(guān)報(bào)道[16].普通變形桿菌與腦膜膿毒性黃桿菌感染導(dǎo)致中華鱉疥瘡病暴發(fā)，致死率達(dá)100%，在我國(guó)尚屬首次發(fā)現(xiàn).

據(jù)報(bào)道，中華鱉疥瘡病傳染性強(qiáng)，流行時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)病率高，死亡率達(dá)20%以上，隨著病程的發(fā)展，疥瘡潰瘍惡化形成穿孔病[5,17].本次自然發(fā)病中華鱉自然發(fā)病病程為6～10個(gè)月，病程長(zhǎng)，疥瘡病理特征明顯，患病前期僅呈現(xiàn)零星死亡，之后隨著病程延長(zhǎng)，中華鱉死亡率顯著上升，可達(dá)100%，但未見穿孔現(xiàn)象.因此推斷中華鱉先是感染普通變形桿菌致使疥瘡病發(fā)生，后隨著病情加重及機(jī)體抵抗力下降，繼而感染腦膜膿毒性黃桿菌，內(nèi)臟器官呈現(xiàn)不同程度的炎癥、出血和淤血癥狀，進(jìn)而引起多器官功能障礙[18-19]，死亡率顯著上升.此外，可能由于水產(chǎn)養(yǎng)殖者亂用藥物治療中華鱉疥瘡，導(dǎo)致病原菌對(duì)20種抗生素藥物均產(chǎn)生了抗藥性.目前，隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的增大，病害發(fā)生愈加頻繁，致病菌種類也愈加繁多，病理特征愈加復(fù)雜，在水產(chǎn)動(dòng)物疾病診斷過(guò)程中，技術(shù)人員不宜單憑表面的病理特征來(lái)判斷疾病種類和開處藥方，還應(yīng)輔以病原菌藥物敏感性試驗(yàn)，保證科學(xué)、合理地選用和使用藥物，延緩病原菌耐藥性的產(chǎn)生.