姜洪雪，姚丹丹，馮志勇

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】嚙齒動(dòng)物是哺乳動(dòng)物中種類最多、分布最廣、數(shù)量最大的類群，其中一些種類對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、人類健康及公共安全造成巨大危害［1-3］。為控制害鼠，通常采用以生態(tài)調(diào)控為基礎(chǔ)的綜合治理技術(shù)，其中化學(xué)防治是極其重要的防控措施。而抗凝血類殺鼠劑是一類慢性化學(xué)藥劑，相對(duì)比較安全、適口性好、滅鼠效率高，自20世紀(jì)80年代，在我國(guó)農(nóng)牧區(qū)和城市廣泛使用［4-6］，是當(dāng)前最主要的殺鼠劑。但是連續(xù)使用超過(guò)6年的地區(qū)陸續(xù)報(bào)道了鼠類抗藥性的產(chǎn)生，抗藥性、交互抗性和抗性種群的出現(xiàn)，大大降低了滅鼠效果，增加了滅鼠難度和成本［7-9］。而新藥創(chuàng)制難度大，且必須同時(shí)滿足“高效、安全、經(jīng)濟(jì)”的特點(diǎn)［10-11］。如何延緩鼠類抗藥性、提高殺鼠劑的利用率、降低殺鼠劑的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)成為亟待解決的問(wèn)題。【前人研究進(jìn)展】已有研究發(fā)現(xiàn)一些藥物等能增強(qiáng)抗凝血?jiǎng)┑淖饔茫?2-15］，馮志勇等［14］將增效劑S和增效劑A按照一定比例分別配制成增效滅鼠劑Ⅰ和增效滅鼠劑Ⅱ用于滅鼠試驗(yàn)，結(jié)果表明，復(fù)配增效滅鼠劑顯著降低抗凝血滅鼠劑的用量，適口性好、安全性高，不僅對(duì)室內(nèi)試驗(yàn)的小白鼠和小家鼠控制效果好，而且對(duì)農(nóng)田的鼠類滅效也較高。王俊超等［15］研究發(fā)現(xiàn)添加了雙氯芬酸鈉、丙三醇等輔料配制的溴敵隆液劑和粉劑能有效毒殺大白鼠、小白鼠、褐家鼠、大倉(cāng)鼠和布氏田鼠，適口性良好，既降低了溴敵隆的濃度，又保證了滅效。而在我國(guó)南方地區(qū)，氣候潮濕多雨，稻谷具有適口性好、保鮮期長(zhǎng)和來(lái)源廣泛的優(yōu)點(diǎn)，是農(nóng)區(qū)滅鼠的最適誘餌。但是抗凝血?dú)⑹髣╇y溶于水，稻殼對(duì)抗凝血?dú)⑹髣┻M(jìn)入米粒具有阻滯作用。張美文等［16］通過(guò)生物測(cè)定及光譜分析表明，谷殼對(duì)敵鼠鈉鹽進(jìn)入米粒中具有50%左右的阻滯率。鼠類只取食稻谷中的米粒，藥物主要粘附在稻谷表層，殘留在田間、戶外的毒谷和毒殼易造成環(huán)境污染及非靶標(biāo)動(dòng)物中毒的風(fēng)險(xiǎn)［17-19］。【本研究切入點(diǎn)】針對(duì)稻谷毒餌利用率低、生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)大的問(wèn)題，以溴敵隆殺鼠劑的溶解性及稻谷毒餌的特性為切入點(diǎn)，研究農(nóng)藥助劑如滲透劑對(duì)抗凝血?dú)⑹髣┑臐B透作用和增效作用，揭示抗凝血?jiǎng)┑脑鲂C(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬通過(guò)篩選助劑增加抗凝血類殺鼠劑的滲透能力，提高稻谷毒餌的利用率，室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)驗(yàn)證助劑對(duì)抗凝血類殺鼠劑控制小白鼠的增效作用，為科學(xué)精準(zhǔn)治理鼠害提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要試劑：大衛(wèi)溴敵隆母液（有效成分含量0.5%，商丘市大衛(wèi)化工廠），溴敵隆標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)AccuStandard公司），色譜純甲醇（美國(guó)Fisher公司），乙酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），二甲基亞砜（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），N, N-二甲基甲酰胺（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

主要儀器：Dionex ultimate 3000高效液相色譜工作站，配熒光檢測(cè)器（Dionex，美國(guó)），HY-5回旋式振蕩器（常州澳華儀器有限公司），KQ2200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

試驗(yàn)動(dòng)物：昆明小白鼠，雌雄各半，共154只，于2019年12月購(gòu)自廣州市黃埔區(qū)長(zhǎng)勝養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2019年12月至2020年4月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所大豐試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2.1 常規(guī)稻谷毒餌及添加助劑后的稻谷毒餌配制方法 0.01%溴敵隆稻谷毒餌：有效成分含量0.5%的溴敵隆母液50 mL兌水200 mL，充分?jǐn)嚢璧谷?.5 kg稻谷中，混勻，待藥液被吸干后，曬干。

0.0025%溴敵隆稻谷毒餌：有效成分含量0.5%的溴敵隆母液5 mL兌水80 mL，充分?jǐn)嚢璧谷?.0 kg稻谷中，混勻，待藥液被吸干后，曬干。

添加1%、2%、4%、8%、24%N,N-二甲基甲酰胺的0.01%溴敵隆稻谷毒餌：準(zhǔn)確稱量5、10、20、40、120 mL二甲基甲酰胺，再分別與35、30、20、0、0 mL水混合，再加入10 mL有效成分含量0.5%的溴敵隆母液，混勻后與500 g稻谷攪拌，混合均勻，待藥液吸干后曬干，配制成濃度為1%、2%、4%、8%、24%的N,N-二甲基甲酰胺0.01%溴敵隆稻谷毒餌。不同濃度二甲基亞砜的0.01%溴敵隆稻谷毒餌的配制方法與N,N-二甲基甲酰胺相同。

添加4%N,N-二甲基甲酰胺的0.0025%溴敵隆稻谷毒餌：準(zhǔn)確稱取40 mL N,N-二甲基甲酰胺與40 mL水混合均勻，再加入5 mL有效成分含量0.5%的溴敵隆母液，混勻后與1.0 kg稻谷攪拌，再次混勻，待藥液吸干后曬干，配制成濃度為添加4%N,N-二甲基甲酰胺的0.0025%溴敵隆稻谷毒餌。添加4%二甲基亞砜的0.0025%溴敵隆稻谷毒餌的配制方法與該濃度N,N-二甲基甲酰胺相同。

1.2.2 溴敵隆稻谷毒餌樣品前處理 將溴敵隆普通毒谷稻殼與糙米手工分離，分別用粉碎機(jī)研磨，過(guò)0.250 mm篩。準(zhǔn)確稱取1 g殼粉及4 g米粉，置于100 mL具塞離心管中，加入甲醇40 mL，加塞后振蕩15 min，超聲提取15 min，3 000 r/min離心5 min。預(yù)先以5 mL甲醇活化中性氧化鋁柱（AL5006-N，Alumina N SPE，500 mg/6mL），棄流出液，分別取殼粉上清液4 mL，米粉上清液5 mL上樣，用10 mL甲醇-乙酸（95:5）溶液洗脫，收集洗脫液，在60℃下用氮?dú)獯蹈?，再? mL甲醇溶解殘?jiān)?，過(guò)有機(jī)濾頭（0.2 μm，13 mm），供高效液相色譜儀測(cè)定。添加助劑的毒谷中溴敵隆樣品前處理方法與普通毒谷相同。

1.2.3 添加助劑的毒谷對(duì)小白鼠的毒殺作用 選擇成年、健康、非孕、無(wú)外傷的個(gè)體，雌性36只，雄性38只，稱量體重，采用無(wú)選擇定量攝食試驗(yàn)，單籠飼養(yǎng)。先用稻谷飼養(yǎng)2 d，然后按體重15%提供毒谷連續(xù)飼喂小白鼠，每天稱毒谷的消耗量，更換新餌。3 d后，清除毒谷，改用飼料正常飼養(yǎng)，觀察14 d，記錄小白鼠死亡時(shí)間，計(jì)算死亡率。

1.2.4 添加助劑的毒谷對(duì)小白鼠的適口性試驗(yàn) 選擇成年、健康、非孕、無(wú)外傷的個(gè)體，雌性41只，雄性39只，稱量體重，采用有選擇攝食試驗(yàn)，單籠飼養(yǎng)。先用稻谷飼養(yǎng)2 d，然后分別將5 g稻谷和5 g溴敵隆毒谷對(duì)角線放入飼養(yǎng)籠內(nèi)，讓小白鼠自由選擇取食，每天稱稻谷和毒谷的消耗量，更換新餌并交換位置。連續(xù)選擇攝食3 d后，清除毒谷，改用飼料正常飼養(yǎng)，觀察14 d，記錄小白鼠死亡時(shí)間，計(jì)算攝食系數(shù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

（1）毒餌中溴敵隆含量測(cè)定方法：采用高效液相色譜法，色譜柱C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫：30℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)310 nm，發(fā)射波長(zhǎng)390 nm；流動(dòng)相A：水+0.25%乙酸；流動(dòng)相B：甲醇+ 0.25%乙酸，梯度洗脫：0～5 min，B保持25%，5～20 min，B升高至95%，20～25 min，B由95%升至100%。

（2）添加助劑后毒餌生物測(cè)定指標(biāo)：毒殺試驗(yàn)中測(cè)定毒餌每天的消耗量，計(jì)算致死時(shí)間及死亡率；適口性試驗(yàn)中測(cè)定無(wú)毒餌和毒餌每天的消耗量，計(jì)算致死時(shí)間及死亡率。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS 16.0進(jìn)行處理和分析，采用LSD最小顯著性差異法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種助劑配制的毒谷糙米中溴敵隆含量

添加不同濃度N,N-二甲基甲酰胺配制的0.01%毒谷與對(duì)照（0.01%毒谷）糙米中溴敵隆含量之間有顯著差異（F＝455.064，df＝5，P≤0.001）。添加8%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.01%毒谷糙米中溴敵隆含量最高，但與添加4%N,N-二甲基甲酰胺的無(wú)顯著差異，添加助劑后糙米中溴敵隆含量均顯著高于對(duì)照糙米中的含量（表1）。

添加不同濃度二甲基亞砜配制的0.01%毒谷與對(duì)照（0.01%毒谷）糙米中溴敵隆含量之間有顯著差異（F＝76.887，df＝5，P≤0.001）。添加4%二甲基亞砜配制的0.01%毒谷糙米中溴敵隆含量最高，顯著高于其他處理。除添加1%二甲基亞砜配制的毒谷糙米中溴敵隆含量與對(duì)照無(wú)顯著差異外，其他濃度二甲基亞砜配制的毒谷糙米中溴敵隆含量均顯著高于對(duì)照（表1）。

表1 添加不同濃度N, N-二甲基甲酰胺及二甲基亞砜配制的0.01%毒谷糙米中溴敵隆含量Table 1 Content of bromadiolone in the brown rice of 0.01% poison grins prepared by different concentrations of N, N-dimethylformamide and dimethyl sulfoxide

表2展示了常規(guī)毒谷（0.01%）、低濃度毒谷（0.0025%）及添加兩種助劑配制的低濃度毒谷中溴敵隆的分布。常規(guī)毒谷中殼含藥量為88.37 μg/g，占總藥量的92.99%，糙米含藥量為6.66 μg/g，占總藥量的7.01%。低濃度毒谷中稻殼含藥量為21.74 μg/g，占總藥量的95.39%，糙米含藥量為1.05 μg/g，占總藥量的4.61%。4%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.0025%毒谷中稻殼含藥量為18.11 μg/g，占總藥量的76.38%，糙米含藥量為5.60 μg/g，占總藥量的23.62%。4%二甲基亞砜配制的0.0025%毒谷中稻殼含藥量為17.99 μg/g，占總藥量的77.39%，糙米含藥量為5.26 μg/g，占總藥量的22.61%。經(jīng)4%N,N-二甲基甲酰胺及4%二甲基亞砜處理后，0.01%溴敵隆毒谷糙米中藥物含量均顯著提高，比常規(guī)的0.01%溴敵隆毒谷分別增加271.17%和163.51%。與低濃度毒谷相比，添加兩種助劑配制的低濃度毒谷中糙米的含藥量顯著提高（4%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敵隆毒谷，t＝-10.110，df＝2.038，P＝0.009；4%二甲基亞砜配制的0.0025%溴敵隆毒谷，t＝-7.722，df＝4，P＝0.002），分別增加433.33%和400.95%。添加兩種助劑配制的低濃度毒谷之間糙米中含藥量沒(méi)有顯著差異（t＝0.488，df＝4，P＝0.651）。

2.2 兩種助劑配制的毒谷對(duì)小白鼠的毒殺作用

如表3所示，添加兩種助劑的低濃度毒谷對(duì)小白鼠的毒殺效果顯著高于未加助劑的低濃度毒谷（4%N,N-二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敵隆 毒 谷，X2＝19.259，df＝1，P＝0.000；4%二甲基亞砜配制的0.0025%溴敵隆毒谷，X2＝15.824，df＝1，P≤0.001），與未加助劑的高濃度毒谷（0.01%溴敵隆毒谷）作用效果相當(dāng)。平均致死時(shí)間，4%二甲基亞砜配制的0.0025%溴敵隆毒谷顯著長(zhǎng)于0.01%溴敵隆毒谷（F＝12.818，df＝3，P≤0.001），其他處理之間沒(méi)有顯著差異，組內(nèi)雌雄個(gè)體沒(méi)有顯著差異。由此可見(jiàn)，添加助劑的毒谷具有明顯的毒殺作用和增效作用。

2.3 兩種助劑配制的毒谷對(duì)小白鼠的適口性

適口性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，兩種助劑的毒谷攝食系數(shù)表現(xiàn)不同，添加4%二甲基甲酰胺的0.0025%毒谷攝食系數(shù)與兩種未添加助劑的對(duì)照沒(méi)有差異（與0.01%毒谷相比：t＝-0.474，df＝38，P＝0.639；與0.0025%毒谷相比：t＝-1.699，df＝25.899，P＝0.101），而添加4%二甲基亞砜的0.0025%毒谷攝食系數(shù)顯著低于兩種未添加助劑的對(duì)照（與0.01%毒谷相比：t＝6.301，df＝20.599，P≤0.001；與0.0025%毒谷相比：t＝7.132，df＝23.624，P≤0.001）?？傮w而言，攝食系數(shù)均超過(guò)0.3的適口性標(biāo)準(zhǔn)，適口性良好，且雌雄之間差異不大。毒殺率結(jié)果與毒殺作用試驗(yàn)結(jié)果一致，添加助劑的毒谷毒殺率顯著高于同樣濃度未添加助劑的毒谷（4%N,U-二甲基甲酰胺配制的0.0025%溴敵隆毒谷，X2＝32.727，df＝1，P≤0.001；4%二甲基亞砜配制的0.0025%溴敵隆毒谷，X2＝ 25.6，df＝1，P≤0.001），與高濃度未添加助劑的毒谷效果相當(dāng)。平均致死時(shí)間，兩種助劑配制的0.0025%溴敵隆毒谷與0.01%溴敵隆毒谷之間無(wú)顯著差異。

表2 0.01%毒谷及4%兩種助劑配制的0.0025%毒谷中溴敵隆含量Table 2 Content of bromadiolone in 0.01% poison grains and 0.0025% poison grains prepared by 4% two adjuvants

表3 兩種助劑配制的溴敵隆毒谷的毒殺效果Table 3 Toxic effect of the bromodiolone poison grains with two adjuvants

表4 兩種助劑配制的溴敵隆毒谷適口性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test result of palatability of the bromodiolone poison grains with two adjuvants

3 討論

殺鼠劑與其他化學(xué)農(nóng)藥不同，必須依賴靶標(biāo)鼠類取食才能發(fā)揮作用，因而毒餌取食效率是關(guān)鍵。稻谷是適合南方滅鼠采用的毒餌，鼠類剝殼食米，米中的含量對(duì)于藥效起到至關(guān)重要的作用，而以往的研究沒(méi)有針對(duì)稻谷毒餌中溴敵隆含量分布展開(kāi)研究。相關(guān)研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，敵鼠納鹽在沸水中具有一定的溶解度，通過(guò)浸泡法配制稻谷毒餌，經(jīng)測(cè)定米中含有敵鼠鈉鹽含量達(dá)到43%，接近一半［16］。本研究結(jié)果表明，0.01%溴敵隆毒谷中90%以上的藥量粘附稻殼上，僅7%的含量存在米中，溴敵隆難溶于水，稻殼的阻滯作用導(dǎo)致藥物難以到達(dá)米粒中，因此，溴敵隆毒谷的利用率有待提高。

阿斯匹林［20-21］、水楊酸鈉［12］、雙氯苯酸鈉［15］等抗凝血?dú)⑹髣┑脑鲂湓鲂C(jī)制是通過(guò)加速動(dòng)物體內(nèi)血液循環(huán)，加快中毒鼠出血速度，從而達(dá)到協(xié)同抗凝血的作用。不同于前人對(duì)于殺鼠劑增效劑的研究，本研究的目的是針對(duì)溴敵隆毒谷糙米中含量偏低這一問(wèn)題，通過(guò)篩選助劑及其適宜的濃度，增加溴敵隆的溶解性和滲透性，提高米粒中的含藥量，從而減低殺鼠劑用量，提高殺鼠劑的利用率。本研究采用的兩種助劑，二甲基亞砜、N,U-二甲基甲酰胺均為用途很廣的優(yōu)良溶劑，能與水及大部分有機(jī)溶劑互溶。通過(guò)高效液相色譜熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4%濃度的兩種助劑滲入米中的溴敵隆含量更高，推斷低濃度的助劑可能滲透力不足，而更高濃度的助劑滲透力已經(jīng)達(dá)到飽和，也可能與其他因素有關(guān)。

從實(shí)驗(yàn)室內(nèi)生物測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)，添加兩種助劑對(duì)低濃度的溴敵隆毒谷增效明顯，與常規(guī)0.01%濃度相比，添加4%助劑的0.0025%溴敵隆毒谷無(wú)論毒殺效果及適口性方面都表現(xiàn)良好，驗(yàn)證了兩種助劑的滲透能力及增效作用，達(dá)到了預(yù)期目的。另外，4%助劑用量配制的稻谷單獨(dú)飼喂對(duì)小白鼠沒(méi)有毒性，而且不影響適口性。與協(xié)同增效的藥物不同，本研究添加了助劑沒(méi)有顯著縮短小白鼠的致死時(shí)間，可能與增效機(jī)制不同有關(guān)，抗凝血?dú)⑹髣儆诼詺⑹髣?，助劑的作用仍然保持抗凝血?jiǎng)┑闹滤罊C(jī)理，但是增加了殺鼠劑在水中的溶解性，提高了殺鼠劑的利用率。類似地，應(yīng)用于害蟲(chóng)防治的殺蟲(chóng)劑，滲透劑類助劑可促進(jìn)有效組分滲透到靶標(biāo)生物體內(nèi)，或者溶解昆蟲(chóng)體壁的蠟質(zhì)層，增強(qiáng)藥液透過(guò)生物表面的能力，從而提高殺蟲(chóng)劑的藥效和降低用量［22-23］。

抗凝血?dú)⑹髣┤匀皇俏磥?lái)一段時(shí)間控制鼠害的重要技術(shù)措施，在抗藥性問(wèn)題日益突出、新藥研制困難的形勢(shì)下，通過(guò)合理使用抗凝血?dú)⑹髣┰鲂?，可以大幅降低殺鼠劑的用量，減少殺鼠劑的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，延緩鼠類對(duì)抗凝血?dú)⑹髣┑目顾幮裕娱L(zhǎng)現(xiàn)有抗凝血?dú)⑹髣┑氖褂脡勖?。本研究后續(xù)將深入開(kāi)展農(nóng)田滅鼠試驗(yàn)及對(duì)非靶標(biāo)生物的安全性試驗(yàn)，以期獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

4 結(jié)論

利用各種農(nóng)藥助劑可以將農(nóng)藥活性成分輸送到作物、雜草、害蟲(chóng)和其他有害生物的靶標(biāo)位點(diǎn)，使其充分發(fā)揮藥效，減少用量，減輕污染。本研究結(jié)果表明，經(jīng)4%N, N-二甲基甲酰胺及4%二甲基亞砜處理后，0.01%溴敵隆毒谷糙米中的藥物含量均顯著提高，添加4%N, N-二甲基甲酰胺和4%二甲基亞砜配制的0.0025%溴敵隆毒谷，糙米中的藥物含量也均顯著增加；而且用4%的兩種助劑配制的0.0025%溴敵隆毒谷，對(duì)小白鼠均具有較好的適口性及毒殺效果。因此，4%N, N-二甲基甲酰胺或4%二甲基亞砜作為助劑對(duì)溴敵隆毒餌均有顯著的增效作用，并可顯著降低殺鼠劑的使用濃度。