張麗，楊志波

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，湖南 長沙 410005)

特應(yīng)性皮炎(Atopic Dermatitis，AD)是臨床上常見的一種皮膚屏障破壞，免疫功能失調(diào)的疾病[1]，據(jù)研究表明AD在發(fā)達(dá)國家兒童的發(fā)病率達(dá)到15%～30%[2]，發(fā)展中國家的患病率也在逐年上升，常好發(fā)于嬰幼兒時期。目前有許多治療特應(yīng)性皮炎的方法，包括支持性護(hù)理、外用皮質(zhì)激素、口服具有鎮(zhèn)靜止癢作用的抗組胺藥物、光療、系統(tǒng)治療等，但缺少一種理想的治療方法。中醫(yī)藥因其簡、便、廉、效的優(yōu)點(diǎn)，逐漸被臨床醫(yī)生廣泛應(yīng)用。其中出自《丹溪心法》的玉屏風(fēng)散，雖僅由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)三味藥組成，但在臨床上治療蕁麻疹、濕疹、帶狀皰疹等皮膚疾病療效佳。周光澤等[3]研究表明玉屏風(fēng)顆粒聯(lián)合鹽酸西替利嗪治療AD較單一使用抗組胺藥的有效率更高，治療4周后患者皮損SCORED評分、瘙癢程度評分以及影響睡眠程度積分明顯降低。李雪嬌[4]應(yīng)用皮下注射塵螨浸液聯(lián)合維生素E外用保濕、口服氯雷他定以及玉屏風(fēng)散顆粒進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)特異性免疫治療聯(lián)合玉屏風(fēng)顆?？娠@著降低AD的復(fù)發(fā)率。研究發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)散之所以對過敏性疾病療效較好，可能與其具有調(diào)節(jié)免疫的功能相關(guān)。劉文杰等[5]發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)散治療脾虛濕蘊(yùn)的AD患者可有效提高患者的細(xì)胞免疫功能，治療后測得患者血清CD4+、CD4+/CD8+比例較治療前降低，CD8+數(shù)值顯著增加。而特應(yīng)性皮炎與免疫失衡及遺傳易感性關(guān)系密切，因此我們推測玉屏風(fēng)散有可治療特應(yīng)性皮炎的潛在作用靶點(diǎn)與機(jī)制。本文擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方式，探討玉屏風(fēng)散治療特應(yīng)性皮炎的作用機(jī)制，為實(shí)驗(yàn)及臨床提供一定的依據(jù)。

1 方法

1.1 篩選玉屏風(fēng)散的化學(xué)成分及靶點(diǎn)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺[6](Traditional Chinese Medicine Pharmacology,TCMSP)中篩選玉屏風(fēng)散(黃芪、白術(shù)、防風(fēng))的化學(xué)成分和相關(guān)靶點(diǎn)，篩選條件為生物利用度(Oral bioavailability，OB)>30和類藥性(Drug likeness，DL)>0.18篩選出符合以上條件的有效化學(xué)成分以及相關(guān)靶點(diǎn)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫和美國國家技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI)限定物種為“Homo Sapiens”，將之前檢索的相關(guān)靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成相對應(yīng)的基因，得到靶點(diǎn)基因名稱。

1.2 獲取AD的相關(guān)靶點(diǎn)

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)中以“atopic dermatitis”為檢索詞搜索相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

在STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)中輸入篩選出的中藥作用于AD的靶點(diǎn)名，限定物種為“Homo Sapiens”，設(shè)置最低相互作用評分為中等置信度(“high confidence(0.700)”)，得到玉屏風(fēng)散作用于AD的PPI網(wǎng)絡(luò)(靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò))。

1.4 篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)

將STRING數(shù)據(jù)庫中得到的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，使用“Network Analyzer”對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取自由度(Degree)、介數(shù)(Betweenness)、中心性(Closeness)大于平均值的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)一步分析其藥理作用。

1.5 GO功能分析

在cytoscaope軟件中使用插件cluego，選擇Functional Analysis，限定物種為“Homo Sapiens”，選擇Celluar component、Biological process、Molecular function，設(shè)定僅顯示P-Value值<0.05。

1.6 KEGG通路富集分析

在DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)導(dǎo)入玉屏風(fēng)散與AD的交集基因，輸入靶基因名稱，限定物種為“Homo Sapiens”，將靶基因名修正為官方名稱，進(jìn)行KEGG通路富集分析，在統(tǒng)計計算R項(xiàng)目運(yùn)行clusterProfiler代碼[7]，得到KEGG富集結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 玉屏風(fēng)散化合物和靶點(diǎn)的篩選

在TCMSP中分別輸入黃芪、白術(shù)、防風(fēng)，限定OB>30，DL>0.18的條件后，得到化合物共46個，具體見表1，逐一在uniprot對應(yīng)后得到305個靶點(diǎn)。

2.2 AD的相關(guān)靶點(diǎn)

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到1 210個相關(guān)靶點(diǎn)基因。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果

將305個化合物靶點(diǎn)與1 210個AD相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到47個共同靶點(diǎn)基因，對應(yīng)玉屏風(fēng)散中24個候選化合物。其中黃芪對應(yīng)12個，防風(fēng)11個，白術(shù)1個，見表1。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將映射的得到的47個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析(圖1)。網(wǎng)絡(luò)中發(fā)生蛋白相互作用的靶點(diǎn)有47個(2個靶點(diǎn)未發(fā)生蛋白相互作用)，見圖1。在cytoscape上進(jìn)行拓?fù)浜?，得出PPI網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的平均自由度為15.617，平均介數(shù)為0.016，平均中心度數(shù)0.589，自由度、介數(shù)、中心度超過平均值的有16個，具體見表2。推測這些靶點(diǎn)是玉屏風(fēng)散治療AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表1 玉屏風(fēng)散中篩選后化合物成分

圖1 玉屏風(fēng)散治療AD靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能分析

47個藥物-疾病交集基因影響了240個生物學(xué)過程(P<0.01)，選取P值排名前20的功能信息，見表3。結(jié)果顯示玉屏風(fēng)散活性成分主要富集在氧化還原過程，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞對乙醇、營養(yǎng)、脂多糖的反應(yīng)，細(xì)胞增殖，細(xì)胞對氨基酸、雌二醇、藥物、寒冷的反應(yīng)等。在分子功能方面，牽涉到蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚化活性、蛋白激酶結(jié)合、氧化還原酶核心、DNA結(jié)合、氧結(jié)合等。在細(xì)胞組成方面，主要存在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、質(zhì)膜、線粒體、細(xì)胞外空間、核質(zhì)、細(xì)胞外外泌體、細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域等。

表2 玉屏風(fēng)散關(guān)鍵靶點(diǎn)的基本信息

2.6 KEGG富集通路分析結(jié)果

通過David數(shù)據(jù)庫中的KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，該47個靶點(diǎn)顯著富集在113調(diào)通路上(P<0.05)，其中前20條主要通路包括，AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、TNF信號通路、前列腺癌、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、麻疹、HIF-1信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染、IL-17信號通路、Toll樣受體、細(xì)胞凋亡、催乳素信號通路、癌癥中的蛋白多糖、乙型肝炎、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、PI3K-Akt信號通路、結(jié)直腸癌、MAPK信號通路、松弛素信號通路、內(nèi)分泌抵抗、EB病毒感染。具體見表4。

3 討論

AD是一種的慢性炎癥性皮膚病。本病主要以長期的皮膚瘙癢、紅斑伴有苔癬樣變?yōu)樘卣鳌Ｓ捎陂L期的瘙癢嚴(yán)重影響患者的生活及睡眠質(zhì)量，Kaaz K等評估了10名AD及銀屑病患者后發(fā)現(xiàn)AD患者的PSQI總分為(8.3±4.2)分，銀屑病患者的PSQI總分(8.1±4.8)分，AD患者的瘙癢程度較銀屑病患者更重[8]。目前對AD并無可取得滿意療效特殊治療的方法。而中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，其作用機(jī)制也更為復(fù)雜。本研究中主要借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法以及各大數(shù)據(jù)庫，探討了玉屏風(fēng)散對AD的作用機(jī)制的預(yù)測研究。結(jié)果表明，玉屏風(fēng)散和AD的交集基因共47個。差異基因富集的生物學(xué)功能、途徑以及細(xì)胞定位主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚化活性、氧化還原酶活性、蛋白復(fù)合物的集合、蛋白磷酸酶結(jié)合等分子功能。主要參與的生物過程有氧化還原過程、Fc-epsilon受體信號穿襖途徑、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、異生素代謝過程、對脂多糖、氨基酸以及雌二醇和藥物的反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝過程等。

表3 藥物-疾病交集基因的GO富集功能信息

表4 藥物-疾病交集基因的KEGG富集功能信息

KEGG富集通路分析表明20條通路與AD發(fā)病顯著相關(guān)，目前研究較為豐富的主要是腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、IL-17信號通路、磷酸肌醇3激酶(PI3k-Akt)信號通路以及TH17細(xì)胞的分化、Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)信號通路。近期研究表明，AD的發(fā)病與遺傳、皮膚屏障功能受損、免疫的失衡以及微生物的定植關(guān)系密切，其中免疫反應(yīng)失常有至關(guān)重要的作用。Th17細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞亞群可以分泌白介素-17、IL-17F、IL-21等細(xì)胞因子[9]，IL-17F、IL-21被證明在自身免疫和組織炎癥中具有關(guān)鍵作用。這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，從而促進(jìn)包括皮膚組織再生[10]。IL-17，是在AD患者發(fā)炎部位常見的高水平細(xì)胞因子，在皮膚疾病當(dāng)中可以誘導(dǎo)黏附分子和趨化因子的表達(dá)，支持細(xì)胞滲透到皮膚，從而加重炎癥反應(yīng)和組織破壞[11]。任小麗等[12]運(yùn)用ELISA測定輕中度AD患者外周血TH17細(xì)胞比例、IL-17以及IL-17F時發(fā)現(xiàn)病情重的患者外周血TH17細(xì)胞比例較輕中度患者水平高，提示IL-17與TH17細(xì)胞在AD的發(fā)病中有重要影響。TNF-α是關(guān)鍵的促炎因子，參與細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡等各個階段，與角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的因子構(gòu)成促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控以AD為代表的炎癥性皮膚病的發(fā)生[13]。PI3k/Akt信號通路是由膜受體酪氨酸酶激活啟動的，參與多種生物學(xué)過程，調(diào)控細(xì)胞凋亡、免疫T細(xì)胞的增殖與活化，常在不同癌癥中異常激活[14]，魏明等[15]對38例AD患者進(jìn)行T細(xì)胞PI3k和Akt活性的監(jiān)測，試驗(yàn)組新鮮分離出的外周T細(xì)胞PI3k和Akt的活性明顯高于對照組，提示AD患者外周血T細(xì)胞存在PI3k/Akt活化異常，患者的外周血中存在激活該通路的細(xì)胞因子。TLRs信號通路是人類模式識別受體家族中最具特征性的成員，可識別檢測多種病原體相關(guān)的分子模式[16]，可激活相關(guān)信號通路，激發(fā)免疫細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)皮膚炎癥，樹突狀細(xì)胞的成熟，以及通過激活Th1或Th17細(xì)胞來發(fā)展抗菌防御。TLR-2和TLR-4信號中的缺陷可能促進(jìn)Th2反應(yīng)，從而導(dǎo)致AD發(fā)展。Antiga E等[17]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過他克莫司或氫化可的松治療的AD患者，TLR-1高表達(dá)，TLR-2低表達(dá)。AD患者外周血可發(fā)生TLRs的表達(dá)異常。TLRs基因多態(tài)性與AD的發(fā)病與病情的發(fā)展存在相關(guān)關(guān)系[18]。

玉屏風(fēng)散是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的經(jīng)典方劑，由黃芪、防風(fēng)、白術(shù)、甘草四味藥物組成，是補(bǔ)氣固表的代表方劑?，F(xiàn)代研究表明玉屏風(fēng)散中以芒柄花素[19]、升麻素苷、毛蕊異黃酮苷、升麻素、補(bǔ)骨脂素等成分為主[20]，有抗菌、調(diào)節(jié)免疫以及抗感染的作用，現(xiàn)廣泛運(yùn)用于治療過敏性疾病以及呼吸系統(tǒng)疾病。劉文杰[21]研究發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)散治療嬰兒期AD患者效果顯著。姚露等[22]通過研究玉屏風(fēng)散的主要有效成分對小鼠AD模型中的炎癥小體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)芒柄花素可有效抑制MC903誘導(dǎo)的AD小鼠模型中NLRP3和IL-33的表達(dá)，從而對玉屏風(fēng)散對治療AD的細(xì)胞分子學(xué)以及信號通路進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)探討。本研究則通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方式，對中醫(yī)經(jīng)典方劑玉屏風(fēng)散治療AD進(jìn)行了作用機(jī)制的預(yù)測，以及從細(xì)胞分子層面初步分析了玉屏風(fēng)散治療AD的依據(jù)。接下來會依據(jù)此研究行進(jìn)一步臨床及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，研究玉屏風(fēng)散治療AD的多通路以及多靶點(diǎn)的機(jī)制，爭取對臨床使用玉屏風(fēng)散治療AD提供明確的科學(xué)依據(jù)。