莫涵瑢 郭書(shū)文 陳曦 李芳赫 占天為 王惠 馮鵬飛 魏路路 劉云柯 魏梵域

心肌纖維化(myocardial fibrosis, MF)是心肌梗死(myocardial infarction, MI)后一重要病理過(guò)程。一方面，發(fā)生心肌梗死后的纖維化瘢痕可以幫助提高室壁硬度，防止心臟破裂；另一方面，由于心肌細(xì)胞再生修復(fù)能力有限，過(guò)度增生的瘢痕會(huì)使心室順應(yīng)性下降，影響心肌正常的舒縮功能，從而引發(fā)各種惡性結(jié)局。而纖維化的過(guò)程中有多種生長(zhǎng)因子和神經(jīng)體液介質(zhì)的參與，其中血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factors, PDGF)是最能說(shuō)明纖維化的介質(zhì)之一，具有促進(jìn)傷口愈合和纖維化的作用[1]，在心肌修復(fù)的增生階段參與刺激肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和成纖維細(xì)胞的增殖[2]。PDGFs在發(fā)育過(guò)程中是間充質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括A、B、C、D四個(gè)亞型，不同亞型的PDGFs具有不同的作用，在某些情況下甚至是相反的作用[3]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)益氣活血藥可以有效減輕心肌纖維化，從而保護(hù)心臟功能[4]，但對(duì)PDGFs不同亞型的影響尚不清晰。因此，本研究進(jìn)一步觀察益氣活血藥對(duì)MI后MF大鼠不同亞型血小板源性生長(zhǎng)因子的影響，為探究益氣活血藥治療MI后MF的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康雄性SD大鼠(SPF級(jí))60只，體重為(220±20)g，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2016-0006。在北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2 主要藥物與試劑

益氣活血藥由生曬參10 g、黃芪30 g、當(dāng)歸15 g、川芎15 g、三七粉6 g組成(該藥物已申請(qǐng)專利，專利申請(qǐng)?zhí)枮?201610368030.7)，中藥由北京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂門(mén)診部藥房統(tǒng)一購(gòu)入，并于北京中日友好醫(yī)院藥劑科根據(jù)口服劑制備工藝水煎過(guò)濾濃縮，調(diào)整濃度為每1 mL相當(dāng)于生藥0.82 g，滅菌分裝至100 mL醫(yī)用玻璃瓶中備用；培哚普利叔丁胺片(雅施達(dá))，規(guī)格：4 mg/片，使用前研磨溶于蒸餾水；注射用青霉素鈉，南京海辰藥業(yè)有限公司成產(chǎn)，規(guī)格：80萬(wàn)U；氯化鈉注射液，華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)，規(guī)格：500 mL/瓶。檢測(cè)用抗體：膠原纖維(collagen)Ⅰ、collagenⅢ、PGDF-B、PDGF-D(Abcam，ab34710、ab7778、ab178409、ab181845)，PGDF-A、PGDF-C(Thermo Fisher，PA5-99405、PA5-45229)，GAPDH(Immunoway，YM3029)，辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(SH-0031)，辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(SH-0011)購(gòu)于北京鼎國(guó)生物有限公司。

1.3 主要儀器

成都泰盟軟件有限公司小動(dòng)物呼吸機(jī)(型號(hào)：HW-101E)，迷你雙垂直電泳槽(DYCZ-24DN型)，迷你轉(zhuǎn)印電泳槽(DYCZ-40D型)，電泳儀(DG-300C)，酶標(biāo)儀(ZS-3板式酶標(biāo)儀)。

1.4 動(dòng)物模型的制備

健康雄性SD大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，采用經(jīng)典心肌梗死動(dòng)物模型制備方法[5]，1%戊巴比妥鈉(4.2 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，背位固定后于左前胸上至鎖骨下至腹部處備皮，行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行人工呼吸(呼吸頻率：80 次/分，呼吸比：1∶2，潮氣量：6 mL)。消毒后于左肋3～4肋間隙處破皮，鈍性分離肌層，暴露打開(kāi)胸腔，剝離心包膜，以小棉球輕按壓肺，暴露左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎點(diǎn)位于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐間下2 mm處，用5/0無(wú)菌帶線縫合針結(jié)扎后可觀察到心臟變白，取出棉球，將心臟復(fù)位關(guān)胸，脫離人工呼吸機(jī)，待大鼠呼吸平穩(wěn)后進(jìn)行肌肉和皮膚縫合。術(shù)后連續(xù)3 天給予腹腔注射青霉素鈉20 萬(wàn)單位/天以預(yù)防感染。假手術(shù)組以上文方法開(kāi)胸暴露心臟后，只在左冠脈前降支處穿線不結(jié)扎，余步驟相同。

1.5 動(dòng)物分組與給藥

術(shù)后第二天對(duì)存活大鼠行術(shù)后心電圖(ECG)，以Ⅰ、avL、V1-V6導(dǎo)聯(lián)病理性Q波數(shù)量≥5個(gè)為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[6]，剔除不滿足成模標(biāo)準(zhǔn)以及無(wú)MI表現(xiàn)的動(dòng)物模型后，將成模動(dòng)物隨機(jī)分入模型組、培哚普利組、益氣活血組，另設(shè)假手術(shù)組做對(duì)照，每組9只。術(shù)后第二天根據(jù)動(dòng)物分組開(kāi)始灌胃給藥，每日1次。給藥劑量根據(jù)人和大鼠等效劑量換算(折算系數(shù)W=6)進(jìn)行計(jì)算，培哚普利根據(jù)臨床常用最大劑量計(jì)算(0.4 mg/kg)，益氣活血藥根據(jù)前期研究經(jīng)驗(yàn)[7]計(jì)算(8.2 g/kg)后進(jìn)行灌胃。連續(xù)治療28天后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 大鼠心肌取材方法 以1%戊巴比妥那(3.2 mL/kg)的麻醉量麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血后摘取大鼠心臟，于4 ℃生理鹽水中泵出心內(nèi)多余血液，冰上取大鼠左心室梗死邊緣區(qū)心肌組織，放入4 %多聚甲醛固定標(biāo)本，凍存管取WB組織于液氮中冰凍保存。

1.6.2 超聲心動(dòng)檢測(cè) 取材前1天以1 %戊巴比妥那(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，胸前區(qū)備皮后，將大鼠背位固定于超聲工作臺(tái)上，待大鼠心率平穩(wěn)后，采用高頻探頭RMV716進(jìn)行定位，通過(guò)M型曲線分析評(píng)價(jià)心臟功能，每組采集連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期計(jì)算平均值。分別測(cè)量記錄大鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)，左室短軸率(left ventricular fraction shortened，LVFS)，左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension systole，LVIDs)，左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)數(shù)值并統(tǒng)計(jì)。

1.6.3 Masson染色 心肌組織石蠟切片進(jìn)行馬松染色，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每個(gè)樣本在顯微鏡鏡下(×200 倍)觀察，隨機(jī)取5個(gè)不重疊的梗死邊緣區(qū)視野，采用ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。CVF=膠原面積/(膠原面積﹢心肌面積)×100 %。

1.6.4 Western-Blot 采用WB檢測(cè)大鼠梗死心肌邊緣區(qū)collagenⅠ、collagenⅢ、PDGF-A 、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D的蛋白表達(dá)。將組織按照10 %加入RIPA裂解液進(jìn)行勻漿，提取蛋白樣本-80 ℃保存?zhèn)溆?。制膠上樣后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜，恒壓80 V轉(zhuǎn)移3 小時(shí))，室溫?fù)u床封閉1小時(shí)，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)加入適當(dāng)比例稀釋的一抗：collagenⅠ和collagenⅢ(1∶2000)，PDGF-A和PDGF-C(1∶1000)，PDGF-B和PDGF-D(1∶4000)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST搖床洗膜3次，每次5分鐘，加二抗孵育2 小時(shí)后(1∶5000)，再次TBST搖床洗膜3次，每次5分鐘。曝光時(shí)根據(jù)肉眼觀察熒光強(qiáng)弱調(diào)整曝光時(shí)間(1～5分鐘)，通過(guò)多次曝光以到達(dá)最佳效果，顯影(約1分鐘)，定影(5～10分鐘)。膠片掃描后，圖像采用Image J軟件對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行圖像分析，各組分別與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行比較得出結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟功能超聲結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS均顯著降低(P<0.01)，而LVIDs、LVIDd顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，培哚普利組和益氣活血藥組LVEF、LVFS顯著升高(P<0.01)，LVIDs、LVIDd則顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 心梗28天各組大鼠超聲數(shù)據(jù)結(jié)果

2.2 各組大鼠馬松染色結(jié)果比較

假手術(shù)組心肌細(xì)胞呈紅染，大小正常，排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)呈藍(lán)染，可見(jiàn)少量膠原纖維；模型組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂且間隙變寬，紅染較黯，部分心肌細(xì)胞肥大，梗死區(qū)域可見(jiàn)廣泛膠原纖維藍(lán)染，彌漫性分布，間質(zhì)大量纖維束將心肌細(xì)胞分隔呈條形或小島狀，大血管周圍可見(jiàn)較多膠原纖維染色存在；兩用藥組病理改變較模型組均有所減輕，梗死區(qū)藍(lán)染面積較模型組減小。

用Image J圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各組大鼠CVF后，結(jié)果顯示心梗28天后，與假手術(shù)組的CVF(5.46±1.19)% 相比，模型組大鼠CVF(72.88±10.58)%顯著升高(P<0.01)，培哚普利組和益氣活血組大鼠CVF[分別為(47.72±9.53)%和(34.98±14.65)%]較模型組顯著下降(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：A假手術(shù)組；B模型組；C培哚普利組；D益氣活血組。

2.3 各組大鼠心肌組織collagenⅠ、collagenⅢ、Ⅰ/Ⅲ型膠原比值表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠collagenⅠ蛋白表達(dá)以及Ⅰ/Ⅲ型膠原比值升高(P<0.05)，collagenⅢ蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，兩用藥組的collagenⅠ蛋白表達(dá)和Ⅰ/Ⅲ型膠原比值下降，接近假手術(shù)組，其中益氣活血組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩用藥組collagenⅢ的蛋白表達(dá)則較模型組顯著上升(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。

注：A假手術(shù)組；B模型組；C培哚普利組；D益氣活血組。

2.4 各組大鼠心肌組織PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)相比，模型組大鼠PDGF-A和PDGF-C的蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)，PDGF-B顯著上升(P<0.01)，PDGF-D未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。與模型組相比，兩用藥組大鼠PDGF-A和PDGF-C的蛋白表達(dá)均有上升，其中益氣活血組PDGF-A的表達(dá)升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而培哚普利組和益氣活血組大鼠PDGF-B蛋白表達(dá)均有下降(P<0.05，P<0.01)，PDGF-D未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3、表3。

注：A假手術(shù)組；B模型組；C培哚普利組；D益氣活血組。

表2 心梗28 天各組大鼠心肌collagenⅠ、collagenⅢ蛋白表達(dá)和Ⅰ/Ⅲ型膠原比值結(jié)果M(P25-P75)

表3 心梗28 天各組大鼠PDGFs蛋白表達(dá)結(jié)果M(P25-P75)

3 討論

本課題所使用益氣活血藥為導(dǎo)師臨床經(jīng)驗(yàn)用方，中醫(yī)理論認(rèn)為“心主血脈”“氣為血帥”，氣助血行，若心氣不足則無(wú)力推送血液于脈內(nèi)流動(dòng)，血脈痹阻，不通則痛，從而引起一系列以氣虛血瘀證為主的臨床表現(xiàn)，故益氣活血療法在有相關(guān)表現(xiàn)的心系疾病中具有廣泛的應(yīng)用。益氣活血藥從當(dāng)歸補(bǔ)血湯劃裁而來(lái)，方中使用生曬參和大劑量黃芪，二者共奏益氣之本，配伍以當(dāng)歸、川芎、三七粉活血止痛，通補(bǔ)兼施，意在“補(bǔ)而不壅滯，通而不傷正”。多年來(lái)在治療心梗疾病的過(guò)程中取得了比較滿意的臨床療效，故選用此方對(duì)心肌梗死后心肌纖維化大鼠PDGFs的影響進(jìn)行研究。

當(dāng)心肌梗死發(fā)生后，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的病理反應(yīng)，膠原纖維在心肌組織中沉積，其中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白是心臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular Matrix ，ECM)的主要成分。在正常的發(fā)育過(guò)程中，兩者的比例應(yīng)呈協(xié)調(diào)表達(dá)，組織成網(wǎng)，以維持正常的心肌結(jié)構(gòu)和舒縮功能[8]。但在纖維化心肌中，膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ比例失調(diào)，collagenⅠ蛋白表達(dá)上調(diào)，馬松染色膠原藍(lán)染區(qū)域增大，CVF也顯著上升，均提示心肌梗死后的膠原過(guò)度沉積現(xiàn)象以及心肌纖維化的形成。另外，發(fā)現(xiàn)了collagenⅢ在模型組中表達(dá)下降，而在兩用藥組中上升的情況?？紤]是由于心肌受損嚴(yán)重，在創(chuàng)面愈合和瘢痕形成的過(guò)程中，呈現(xiàn)collagenⅠ上升的趨勢(shì)，而collagenⅢ顯示出減少的跡象[9]。

PDGF是一種可以有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞和其他間充質(zhì)細(xì)胞分裂，并具有趨化作用的生長(zhǎng)因子。其由PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D四個(gè)成員組成。在心臟纖維化的過(guò)程中，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵標(biāo)志，而PDGFs則是這個(gè)過(guò)程中的重要介質(zhì)[1]。Ma等[10]也在醋酸脫氧皮質(zhì)酮/鹽(DOCA/salt)誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型中，通過(guò)使用PDGFs通路抑制劑伊馬替尼成功抑制了纖維化的發(fā)生。盡管一般認(rèn)為，同工型的生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞的作用也應(yīng)大致相同，但也有證據(jù)表明同工型的生長(zhǎng)因子在疾病發(fā)展過(guò)程中也可能發(fā)揮著不同的活性功能[11]。

在正常心肌組織中，PDGFs的4位成員均有表達(dá)。其中PDGF-A和PDGF-C的蛋白表達(dá)在模型組中呈下降趨勢(shì)，而兩者在用藥組中升高，考慮PDGF-A和PDGF-C在心梗過(guò)程中是起保護(hù)心臟作用的因子。Zhao等[11]觀察發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)的血小板源性生長(zhǎng)因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)與梗死心肌中的PDGF-A和PDGF-D共定位，并認(rèn)為這說(shuō)明了PDGF-A和PDGF-D以自分泌/旁分泌方式在心臟修復(fù)中發(fā)揮作用。這也與Zhao等人得出的結(jié)論相符合。益氣活血藥可通過(guò)刺激PDGF-A的上升一定程度上發(fā)揮保護(hù)心肌的作用。

而PDGF-B在國(guó)內(nèi)外的研究中顯示參與了心肌梗死后心肌纖維化的過(guò)程。Radiosa Gallini等[12]學(xué)者認(rèn)為PDGF-B的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致局灶性的纖維化和中度心肌肥大。程志清等[13]也使用三七總皂苷降低了病毒性心肌炎小鼠模型慢性期PDGF-B的表達(dá)，從而抑制了心肌膠原的增生。因此，可以認(rèn)為培哚普利和益氣活血藥都可以通過(guò)抑制PDGF-B的活性減少纖維化，且益氣活血藥的效果優(yōu)于培哚普利。此外，肌成纖維細(xì)胞在正常心肌中不表達(dá)，但會(huì)在梗死心肌中聚集表達(dá)。抑制PDGFs通路雖然不會(huì)減少梗死心肌中肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量，但在第4周可以顯著降低未梗死心肌的CVF[14]。因此，猜想益氣活血藥可能是通過(guò)限制梗死邊緣區(qū)健存心肌的纖維化而發(fā)揮保護(hù)心肌的作用。

PDGF-D的蛋白表達(dá)在心梗后28天的觀察中，無(wú)論是模型組還是用藥組均未呈現(xiàn)明顯的變化趨勢(shì)。針對(duì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在今后的研究中可以使用免疫熒光技術(shù)追蹤定位PDGF-D是否存在組織細(xì)胞中的位移，或通過(guò)增加觀察的時(shí)間點(diǎn)和觀察區(qū)域(如心肌梗死區(qū)、邊緣區(qū)、健存區(qū)等)，從而進(jìn)一步探究心肌梗死后心肌纖維化過(guò)程中PDGF-D的變化特點(diǎn)。

綜上內(nèi)容，心肌纖維化作為多種心系疾病的繼發(fā)癥狀，其治療藥物仍主要通過(guò)沙坦類[15]、他汀類[16]等降壓降脂藥物緩解纖維化癥狀，西藥在抗心肌纖維化方面并沒(méi)有公認(rèn)的藥物。相較來(lái)看，益氣活血藥在減輕心肌纖維化方面具有一定優(yōu)勢(shì)，可能通過(guò)激活PDGF-A，并且主要抑制PDGF-B的活性進(jìn)行抗纖維化，從而發(fā)揮保護(hù)心臟的作用。