李輝，劉登湘，韓翠平

（邢臺市人民醫(yī)院 1. 肝膽外科，2. 放療科，3. CT 室，河北 邢臺 054031）

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，具有惡性程度高、進展迅速、高病死率等特點，在惡性腫瘤中，肝癌的病死率居第2 位[1]。隨著醫(yī)療條件的改善，肝癌患者生存率得到較大幅度的提高，但是其高轉(zhuǎn)移率和高復發(fā)率成為腫瘤治療的最大障礙[2]。癌細胞轉(zhuǎn)移過程是多基因參與調(diào)控的復雜過程，該過程涉及基因的異常表達和相關信號傳導通路的異常激活[3]。蟲草素即3'- 脫氧腺苷，是北冬蟲夏草和冬蟲夏草的主要活性成分。蟲草素具有廣泛的藥理作用，如抑菌、抑制蛋白激酶活性、抑制病毒等[4-5]。研究顯示，蟲草素能通過激活AMPK 信號通路抑制耐藥性非小細胞肺癌進展[6]。還有文獻報道，蟲草素可通過激活AMPK 和抑制AKT 信號通路增強膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的化學敏感性。提示蟲草素具有抗腫瘤作用[7]。本文觀察蟲草素對肝癌細胞遷移和侵襲的影響，并對其作用機制進行探討，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器

人肝癌細胞株Bel-7402 購自中國科學院上海細胞庫。胰酶、胎牛血清（FBS）和RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），甲基噻唑基四唑（MTT）和蟲草素（美國Sigma 公司），二甲基亞砜（DMSO）（國藥集團），GAPDH、ERK、p-ERK、EGFR、p-EGFR、MMP-2 和MMP-9 抗體（美國CST 公司），聚合酶鏈反應引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，SYBY Green PCR Kit（大連TaKaRa 公司），Infinite M200 酶標儀（美國Tecan 公司），GE-680 凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT 法檢測蟲草素對細胞活力的影響取對數(shù)生長期的模型細胞，以每孔7×103個細胞接種于96 孔板中。待細胞貼壁后加入不同濃度的蟲草素（0、20、40、80、160、320 和640 μmol/L），設置空白對照組，加入培養(yǎng)液和二甲亞砜（DMSM），每組設置5 個重復孔，置于37℃、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，蟲草素作用48 h 后每孔加入MTT 溶液（5 g/L）10 μl，二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 ～4 h 后，每孔加入100 μl DMSO 溶液，37℃震蕩20 min 后用酶標儀檢測波長570 nm 處的吸光度（OD）值，并計算肝癌細胞Bel-7402 的存活率。細胞活力=（OD加藥組-OD空白對照組）/OD空白對照組×100%。

1.2.2 劃痕實驗檢測細胞遷移能力取生長狀態(tài)良好的模型細胞用胰酶消化成單細胞懸液后，以每孔2×105個細胞接種于6 孔板中（6 孔板背面劃好標記線），待細胞密度接近90% 時棄掉培養(yǎng)基，用無菌10 μl 槍頭垂直于標記線劃痕，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去脫落和狀態(tài)不良的細胞，加入蟲草素（40和80 μmol/L），并設置空白對照組，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，用倒置顯微鏡拍照，在0 和48 h 下各取4 個視野拍照，實驗重復3 次。

1.2.3 侵襲小室實驗檢測細胞侵襲能力提前稀釋好Matrigel 膠，取150 μl 加入侵襲小室中，37℃培養(yǎng)箱中孵育50 min。用含0.1% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基將細胞制備成單細胞懸液1×108～1×109個/L。侵襲小室上室每孔加入200 μl 細胞懸液，下室中加入800 μl 含有30% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基，并于上下室中加入終濃度為40 和80 μmol/L 的蟲草素，置于37℃、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后用鑷子取出小室，PBS 漂洗后用棉簽輕輕擦去殘留的細胞碎片，放于通風處風干。置于含有0.1% 結(jié)晶紫的甲醇溶液中染色25 min，PBS 漂洗干凈并風干。顯微鏡下觀察膜底細胞數(shù)目并進行拍照統(tǒng)計。顯微鏡記錄5 個視野中細胞數(shù)目，每個實驗設置2 個復孔，實驗重復3 次。

1.2.4 qRT-PCR 檢 測MMP-2 和MMP-9 mRNA表達水平取對數(shù)生長期的模型細胞接種于6 孔板中，待長至70% 密度時加入蟲草素（40 和80 μmol/L）作用48 h，并以等體積溶劑處理作為空白對照組。48 h后提取總RNA，提取的總RNA 按Prime ScriptTMRT Master Mix 試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成的cDNA 按照SYBY Green PCR Kit 試劑盒說明書進行qRT-PCR 反應，每個濃度下的cDNA 設置3 個重復孔，每次實驗重復3 次。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.5Western blotting 實驗檢測MMP-2 和MMP-9蛋白表達將模型細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁達70% 密度時加入40 和80 μmol/L 的蟲草素作用48 h，并以等體積溶劑處理作為空白對照組。48 h 后棄培養(yǎng)基用預冷的PBS 洗2、3 次；細胞刮將細胞刮下收集至離心管，于提前預冷的4℃離心機2 500 r/min，離心5 min ；棄掉PBS，根據(jù)細胞含量加入適量蛋白裂解液，冰上裂解10 min，每2 分鐘渦旋1 次；12 500 r/min，離心20 min ；取上清液置于新的離心管中，BCA 法檢測蛋白含量；加入5× 上樣緩沖液渦旋混勻并離心，沸水浴變性10 min。12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5% 脫脂牛奶封閉后，加入一抗，室溫孵育2 h 回收一抗，TBST 洗膜3 次，用含有辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，10 min/ 次，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并進行灰度值計算。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism 5.0 軟件，計量資料以均數(shù)± 標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 蟲草素對模型細胞細胞活力的影響

給 予0、20、40、80、160、320 和640 μmol/L蟲草素處理48 h 后，MTT 法檢測結(jié)果顯示，不同濃度蟲草素作用下模型細胞活力為（100.00±0.00）%、（98.16±3.18）%、（97.48±8.46）%、（95.64±7.36）%、（90.14±10.17）%、（62.13±10.42）% 和（44.82±11.63）%，各組細胞活力比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=34.090，P=0.000）。0 ～80 μmol/L 蟲草素對細胞活力無明顯影響；而80 ～640 μmol/L 時，細胞活力下降；與0 μmol/L 比較，320 和640 μmol/L 時細胞活力顯著下降（t=8.117 和10.599，均P=0.000）。見圖1。

圖1 蟲草素對Bel-7402 細胞活力的影響

2.2 蟲草素抑制模型細胞遷移和侵襲

劃痕實驗結(jié)果顯示，空白對照組，40 和80 μmol/L蟲草素對細胞遷移的抑制率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與空白對照組比較，40 和80 μmol/L 蟲草素均能抑制細胞的遷移（t=12.692、18.448，均P=0.000）（見表2 和圖2）。侵襲小室實驗結(jié)果顯示，空白對照組，40 和80 μmol/L 蟲草素對細胞侵襲的侵襲率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與空白對照組比較，40 和80 μmol/L 蟲草素均能抑制細胞的侵襲（t=6.055 和3.422，均P=0.000）（見表2 和圖3）。

表2 不同濃度蟲草素對模型細胞遷移和侵襲的影響（%，±s）

表2 不同濃度蟲草素對模型細胞遷移和侵襲的影響（%，±s）

注：與空白對照組比較，P ＜0.05。

組別 細胞遷移 細胞侵襲空白對照組 92.54±3.28 100.00±23.48 40 μmol/L 組 51.67±6.41? 35.66±3.65?80 μmol/L 組 49.67±4.03? 62.45±7.12?F 值 128.959 25.463 P 值 0.000 0.000

圖2 蟲草素對細胞遷移能力的影響

圖3 蟲草素對細胞侵襲能力的影響

2.3 蟲草素抑制MMP-2、MMP-9 mRNA 和蛋白表達

RT-qPCR 和Western blotting 結(jié)果顯示，空白對照組，40 μmol/L 組、80 μmol/L 組處理蟲草素48 h后MMP-2 mRNA 表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白對照組與40 μmol/L 組、80 μmol/L 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.462 和15.125，均P=0.000），40 μmol/L 與80 μmol/L 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.939，P=0.001）；空白對照組，40 μmol/L組、80 μmol/L 組蟲草素處理48 h 后MMP-9 mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白對照組與40 μmol/L 組、80 μmol/L 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.250 和17.488，均P=0.000），40 μmol/L 組與80 μmol/L 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.059，P=0.016）。見表3 和圖4。

表3 不同濃度蟲草素對MMP-2、MMP-9 mRNA 表達水平的影響 （±s）

表3 不同濃度蟲草素對MMP-2、MMP-9 mRNA 表達水平的影響 （±s）

注：①與空白對照組比較，P ＜0.05；②與40 μmol/L 組比較，P ＜0.05。

組別 MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA空白對照組 100.00±0.00 100.00±0.00 40 μmol/L 組 62.42±11.25① 51.18±17.46①80 μmol/L 組 28.29±10.59①② 23.82±9.75①②F 值 80.761 55.823 P 值 0.000 0.000

圖4 蟲草素抑制MMP-2、MMP-9 mRNA 和蛋白表達水平

空白對照組，40 μmol/L 組、80 μmol/L 組蟲草素處理48 h 后MMP-2 蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白對照組與40 μmol/L 組、80 μmol/L 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.608 和33.740，均P=0.000），40 μmol/L 組與80 μmol/L 組比較，差異有統(tǒng)計 學 意 義（t=6.381，P=0.000）；空 白 對 照 組，40 μmol/L 組、80 μmol/L 組 蟲 草 素 處 理48 h 后MMP-9 蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白對照組與40 μmol/L 組、80 μmol/L 組比較， 差異有統(tǒng)計學意義（t=6.393 和31.290，均P=0.000），40 μmol/L 組與80 μmol/L 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.762，P=0.000）。見表4 和圖4。

2.4 蟲草素抑制p-ERK 和p-EGFR 蛋白表達

Western blotting 結(jié)果顯示，空白對照組，40 μmol/L組、80 μmol/L 組蟲草素處理48 h 后p-ERK 表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白對照組與40 μmol/L組、80 μmol/L 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.219和25.273，均P=0.000），40 μmol/L 組與80 μmol/L 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.459，P=0.000）；空白對照組、40 μmol/L 組、80 μmol/L 組蟲草素處理48 h后p-EGFR 表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白對照組與40 μmol/L 組、80 μmol/L 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.998 和52.212，均P=0.000），40 μmol/L組與80 μmol/L 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.247，P=0.000）。見表5 和圖5。

表5 各組p-ERK、p-EGFR 蛋白表達水平的比較（±s）

表5 各組p-ERK、p-EGFR 蛋白表達水平的比較（±s）

組別 p-ERK 蛋白 p-EGFR 蛋白空白對照組 100.00±0.00 100.00±0.00 40 μmol/L 組 75.46±7.54 52.49±6.23 80 μmol/L 組 45.68±4.78 23.45±3.24 F 值 138.828 451.994 P 值 0.000 0.000

表4 各組MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平的比較 （±s）

表4 各組MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平的比較 （±s）

注：①與空白對照組比較，P ＜0.05；②與40 μmol/L 組比較，P ＜0.05。

組別 MMP-2 蛋白 MMP-9 蛋白空白對照組 100.00±0.00 100.00±0.00 40 μmol/L 組 61.52±8.76① 67.26±8.87①80 μmol/L 組 26.37±3.78①② 41.29±3.25①②F 值 222.885 145.079 P 值 0.000 0.000

圖5 蟲草素抑制p-ERK 和p-EGFR 蛋白表達

3 討論

肝癌是目前常見的惡性腫瘤，是導致人類死亡的腫瘤之一。細胞內(nèi)多種信號傳導通路異常是肝癌發(fā)病的主要機制。EGFR 是位于細胞膜上的一種糖蛋白受體，由3 個部分組成：膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)[8]，在各種腫瘤細胞表面EGFR 呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR 特異性抑制劑AG1478 能夠抑制多種肝癌細胞的增殖，這充分說明EGFR 在肝癌進展中發(fā)揮重要的作用[9]。

研究已證實，蟲草素能抑制肝癌HepG2 細胞和結(jié)腸癌HCT116 細胞遷移及侵襲[10-11]。而本研究發(fā)現(xiàn)蟲草素能抑制人肝癌Bel-7402 細胞遷移和侵襲，與上述研究結(jié)果類似。一般來說，當配體與EGFR 的膜外區(qū)結(jié)合后，細胞內(nèi)的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，并進一步磷酸化激活下游信號傳導通路，如PI3K/Akt、MAPK/ERK 等[12]。研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素能夠抑制肝癌細胞MHCC97H 中MMP-2 和MMP-9 的表達，從而抑制細胞遷移和侵襲[13]。而MAPK 信號通路在MMP-2 和MMP-9 轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮重要作用[14-15]，并且EGFR 參與MAPK/ERK 通路的上游調(diào)控[16]?；谏鲜鲅芯浚菊n題組推測蟲草素抑制肝癌細胞的遷移與侵襲作用可能與其抑制EGFR/ERK 信號通路有關。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的蟲草素可以明顯抑制人肝癌細胞Bel-7402遷移和侵襲，且下調(diào)MMP-2 和MMP-9 的mRNA 和蛋白表達，這與文獻報道相一致。通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素可以抑制ERK 磷酸化，該作用隨藥物濃度增加而增強。EGFR 是ERK 的上游調(diào)控靶點，為進一步驗證EGFR 是否參與其中，本研究分析蟲草素與EGFR 活化的關系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蟲草素能顯著抑制EGFR 磷酸化。提示蟲草素可能通過EGFR/ERK 通路來調(diào)節(jié)細胞遷移和侵襲活動。

綜上所述，蟲草素可能通過EGFR/ERK 通路介導的MMP-2 和MMP-9 表達下調(diào)，從而調(diào)控細胞的遷移和侵襲活動。本實驗初步探討蟲草素對人肝癌細胞Bel-7402 遷移和侵襲的抑制作用，將為臨床肝癌的預防和治療提供新的選擇，但其具體作用機制仍需進行深入探討研究。