鄭琛 石超吉 杜琳娟 江銀華 蘇吉梅

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院口腔科 國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310052；

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面頭頸腫瘤科國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200011；

3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院 麗水市人民醫(yī)院口腔科，麗水 323000

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其5年生存率僅為50%～60%[1-2]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移特性是造成患者預(yù)后較差的重要原因之一。

成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth fac tor receptor，F(xiàn)GFR）是多種癌癥的靶向標(biāo)志物[3-4]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5種FGFR，分別是FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4和FGFR5。成纖維細(xì)胞生長因子受體樣蛋白1（fibroblast growth factor receptor like 1，F(xiàn)GFRL1）即FGFR5，是FGFR家族中第5位成員[5-7]。經(jīng)典FGFR為單鏈穿膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括胞外區(qū)、單次穿膜區(qū)以及酪氨酸激酶區(qū)，胞外區(qū)由前導(dǎo)肽和D1、D2、D3區(qū)中的3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域lg1、lg2、lg3構(gòu)成，胞內(nèi)C端有酪氨酸激酶區(qū)[8]。FGFRL1在胞外區(qū)包含類似3個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和1個單次穿膜區(qū)，但胞內(nèi)C端沒有任何酪氨酸激酶區(qū)[5]。FGFRL1與配體相互作用，由于其缺乏細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，無法正常激活信號及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，故其功能與經(jīng)典FGFRs不同[9]。

研究[10-11]表明，在喉癌及食管癌中，F(xiàn)GFRL1具有促進(jìn)腫瘤增殖的作用。缺乏FGFRL1可導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的運動性降低和腫瘤增殖減弱[12]。Schild等[13]利用聚合酶鏈反應(yīng)（polyme rase chain reac-tion，PCR）技術(shù)檢測5種卵巢腫瘤中FGFRL1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)一些卵巢腫瘤組織中FGFRL1的表達(dá)低于正常組織，但在另一個卵巢腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)FGFRL1的表達(dá)量較正常組織高25倍。也有學(xué)者[10]發(fā)現(xiàn)下調(diào)FGFRL1的表達(dá)可降低喉癌細(xì)胞（SCC10A）的增殖。由此可見，F(xiàn)GFRL1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。

本研究使用FGFRL1 siRNA轉(zhuǎn)染OSCC細(xì)胞，以探查FGFRL1與OSCC增殖和侵襲性之間的關(guān)系，并分析FGFRL1在OSCC診斷和預(yù)后中的價值，以期為臨床診療提供參考。

1 材料和方法

本研究組織來源于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面部腫瘤組織樣本庫，樣本庫樣品收集經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會審批通過。

1.1 病例資料

采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取2017年1月—2018年12月就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面頭頸腫瘤科的OSCC患者4例，其中男性2例，女性2例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：1）原發(fā)性O(shè)SCC；2）術(shù)前未經(jīng)過放療、化療及生物治療；3）無全身系統(tǒng)性疾病。病理診斷依據(jù)2018年WHO標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2 材料和試劑

達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modi-fied Eagle medium，DMEM）、胎牛血清（Gibco公司，美國）；Protein marker（Thermo公司，美國）；神經(jīng)鈣黏附素蛋白（N-cadherin）、上皮鈣黏附素蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、CD44抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Abcam公司，美國）；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylin-dole，DAPI）、0.25%胰蛋白酶（Invitrogen公司，美國）；BCA蛋白濃度試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）及NC siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；黏附載玻片（北京創(chuàng)博環(huán)球生物科技有限公司）；Transwell室（Corning公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HN4、CAL27、KB、SCC9、SCC25細(xì)胞由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院提供，HOK細(xì)胞購自北京北方生物技術(shù)研究所。HN4、CAL27、KB用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；SCC9、SCC25用含有10%胎牛血清的DMEM F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；HOK用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至90%融合，進(jìn)行細(xì)胞傳代或用于實驗。所有細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長。使用0.25%胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，傳代培養(yǎng)以備后續(xù)實驗使用。

1.3.2 免疫熒光檢測FGFRL1蛋白的表達(dá) 將HN4細(xì)胞鋪于提前放置好玻璃爬片的12孔板中，24 h后在將已爬好細(xì)胞的載玻片用PBS浸洗2次，每次3 min。用4%的多聚甲醛固定爬片15 min后，PBS浸洗玻片3次，每次3 min。0.5%Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min，PBS浸洗，在玻片上滴加5%正常山羊血清，37 ℃封閉30 min。擦去封閉液，不洗，每張玻片滴加50 μL稀釋好的抗體并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。設(shè)無PBS陰性對照組。次日，PBS浸洗爬片3次，每次3 min，擦去爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37 ℃孵育1 h，PBS浸洗切片3次，每次3 min；滴加含有DAPI的封片劑，封片。加熒光二抗及DAPI的操作需要避光進(jìn)行。應(yīng)用熒光顯微鏡對染色結(jié)果進(jìn)行觀察，綠色區(qū)域為相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，藍(lán)色代表細(xì)胞核。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 采用Tri-zol提取總RNA，測定樣品總RNA濃度后，取1 μg總RNA按cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取合成cDNA作為模版，應(yīng)用LightCycler480 SYBR Green I Master試劑進(jìn)行qRT-PCR檢測。反應(yīng)體系如下：20 μL合成cDNA進(jìn)行5倍稀釋后取每孔1 μL，加正反向Fgfrl1及內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增引物每孔0.1 μL，雙蒸餾水（ddH2O）每孔3.8 μL，2×qPCR mix（ABI）試劑5 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min激活酶活性；PCR循環(huán)：95 ℃ 10 s變性， 60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸，擴(kuò)增45個循環(huán)；95 ℃ 5 s、65 ℃ 1 min、97 ℃溶解，40 ℃ 10 s 冷卻，反應(yīng)引物如下。FGFRL1正向引物序列為：5’-GCAGGTTCT-TCAGGCTCAGT-3’，反向引物序列為：5’-CTGG-ACCTTCCTTCTTCAGC-3’，引物大小為269 bp；GAPDH正向引物序列為：5’-CGGAGTCAACGGAT-TTGGTCGTAT-3’，反向引物序列為：5’-AGCCTT-CTCCATGGTGGTGAAGAC-3’，引物大小為253 bp。

1.3.4 FGFRL1 siRNA轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種12孔培養(yǎng)板，每孔2.5×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，轉(zhuǎn)染前0.5 h更換新鮮培養(yǎng)液（2%FBS+DMEM）。將4 μL Lipo2000與100 μL減血清培養(yǎng)基（reduced serum medium modi-fication of MEM，opti-MEM）混勻，4 μL陰性siRNA（5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3’）與 100 μLopti-MEM混勻，靜置5 min，將Lipo2000加入到陰性對照組中，按照Negative control siRNA︰Lipo2000=1︰1的比例結(jié)合成復(fù)合物，靜置20 min。同時選取最佳的siRNA序列，F(xiàn)gfrl1 siRNA序列為5’-GTGGA-TGTGATCCAGCGGAC-3’。將4 μL Lipo2000與100 μL opti-MEM混勻，4 μL Fgfrl1 siRNA與100 μL opti MEM混勻，靜置 5 min，將Lipo2000加入到陽性對照組中，按照Fgfrl1 siRNA︰Lipo2000=1︰1的比例結(jié)合成復(fù)合物，靜置20 min。48 h后換液，72 h后收集細(xì)胞提取蛋白及RNA，進(jìn)行Western blot及qRT-PCR檢測。

1.3.5 CCK-8及Ki67實驗檢測細(xì)胞增殖 對于轉(zhuǎn)染FGFRL1 siRNA的HN4細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為每毫升1×104個，加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200 μL，以相同濃度轉(zhuǎn)染NC siRNA的HN4細(xì)胞作對照，每組設(shè)4個復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)下培養(yǎng)。分別在孵育24、48和72 h觀察細(xì)胞，PBS洗滌，每孔加90 μL新鮮DMEM培養(yǎng)基，再加入10 μL CCK 8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的光密度（optical density，OD）值，NC siRNA細(xì)胞組的OD450為參照，求出各組的相對OD450值。

1.3.6 細(xì)胞劃痕實驗 將HN4細(xì)胞接種于六孔板中完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%后，對HN4細(xì)胞進(jìn)行FGFRL1 siRNA轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%為佳，用滅菌移液槍頭在培養(yǎng)皿底面輕輕地制造劃痕，PBS洗滌細(xì)胞后分別加入無血清的培養(yǎng)基。在12、24及36 h后對劃痕位置進(jìn)行觀察拍照并測定劃痕兩側(cè)細(xì)胞遷移距離。重復(fù)實驗，取2次平均值進(jìn)行統(tǒng)計。

1.3.7 Transwell實驗 使用Transwell室（孔徑為8 μm）進(jìn)行Transwell遷移測定。將轉(zhuǎn)染了FGFRL1 siRNA的HN4細(xì)胞（每孔2×104個）接種在500 μL無血清培養(yǎng)基中的12孔板的上腔中，下腔室充滿1 mL完全培養(yǎng)基。將其放在37 ℃下孵育12 h及24 h。然后用棉簽去除位于膜上表面的細(xì)胞。使用甲醇固定位于下腔室中的細(xì)胞，并使用Giemsa染色。通過倒置顯微鏡拍攝圖像并采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡法 將提取的蛋白定量后，取35 μg總蛋白，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳至蛋白marker完全分離后，采用濕轉(zhuǎn)法（300 mA，120 min）轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，剪切目的蛋白所在位置的條帶，加入1︰1 000稀釋的抗Fgfrl1、抗E-cadherin、抗N-cadherin、抗波形蛋白單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，Tris-Buffered Saline Tween（TBST）洗膜3次，每次10 min。1︰1 000稀釋的二抗在室溫下孵育1 h，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光液，在暗室中曝光、顯影、定影，電腦掃描，記錄并分析結(jié)果。以GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J分析軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，應(yīng)用Graph-Pad Prism 5.0軟件繪圖，結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)K-S檢驗證實符合正態(tài)分布，方差分析中數(shù)據(jù)符合方差齊性，以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FGFRL1在OSCC組織及鄰近的非腫瘤組織中的表達(dá)

FGFRL1蛋白在OSCC組織中的表達(dá)量（1.329±0.116 6）高于癌旁正常組織（t=2.820，P=0.047 8）（圖1）。

2.2 FGFRL1在正常上皮細(xì)胞株及OSCC細(xì)胞株中的表達(dá)情況

FGFRL1蛋白在OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)量高于在HOK細(xì)胞中的表達(dá)量（圖1）。qRT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)GFRL1 RNA在HOK細(xì)胞中的表達(dá)量（1.000±0.260 3）低于在OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)量[其中HN4細(xì)胞中的表達(dá)量（7.938±0.890 9）（P=0.001 7），CAl27細(xì)胞中的表達(dá)量（7.346±0.531 6）（P=0.000 4），KB細(xì)胞中的表達(dá)量（4.849±0.496 5）（P=0.002 4），SCC9細(xì)胞中的表達(dá)量（7.272±0.387 0）（P=0.000 8）]，HOK與各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫熒光顯示FGFRL1蛋白在HN4細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)（圖2）。

圖 2 免疫熒光檢測FGFRL1蛋白在HN4細(xì)胞中的表達(dá) 熒光顯微鏡 × 400Fig 2 Immunofluorescence detection of FGFRL1 protein expression in HN4 cells fluorescence microscope × 400

2.3 經(jīng)FGFRL1 siRNA處理后，F(xiàn)GFRL1蛋白在HN4細(xì)胞中的表達(dá)情況

HN4細(xì)胞經(jīng)FGFRL1 siRNA處理后，F(xiàn)GFRL1表達(dá)量為（0.344±0.032 0），經(jīng)NC siRNA處理后，F(xiàn)GFRL1表達(dá)量為（0.738±0.001 0），2組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.310，P=0.006 5）（圖3）。

2.4 FGFRL1 siRNA干擾處理HN4細(xì)胞對于細(xì)胞增殖的影響

將FGFRL1 siRNA轉(zhuǎn)染的HN4細(xì)胞作為實驗組，將NC siRNA處理的HN4細(xì)胞作為對照組。Ki67免疫熒光試驗檢測細(xì)胞增殖活力，48 h時，實驗組和對照組細(xì)胞增殖活力分別為56.86±1.629、58.52±1.473，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.756，P=0.478 1）；72 h時，實驗組和對照組細(xì)胞增殖活力分別為36.32±1.250、39.82±3.097，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.050，P=0.334 2）（圖4）。CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖活力，24 h時，實驗組和對照組細(xì)胞增殖活力分別為1.071±0.022 8、1.034±0.007 4，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.525，P=0.165 7）；48 h時，實驗組和對照組細(xì)胞增殖活力分別為1.642±0.027 4、1.593±0.063 6，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.702，P=0.502 6）；72 h時，實驗組和對照組細(xì)胞增殖活力分別為1.818±0.056 7、1.767±0.046 3，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.688，P=0.510 7）。

圖 3 蛋白印跡法檢測2組OSCC細(xì)胞中FGFRL1的表達(dá)Fig 3 The expression of FGFRL1 in two groups of OSCC was de -tected by Western blot

圖 4 轉(zhuǎn)染后72 h，2組細(xì)胞Ki67免疫熒光檢測結(jié)果 熒光顯微鏡 × 100Fig 4 Ki67 results of cells in two groups after transfectioned 72 hours fluorescence microscope × 100

2.5 FGFRL1 siRNA干擾處理HN4細(xì)胞對于細(xì)胞遷移的影響

在細(xì)胞劃痕實驗中，將FGFRL1 siRNA轉(zhuǎn)染的HN4細(xì)胞作為實驗組，將NC siRNA處理的HN4細(xì)胞作為對照組。12 h時，實驗組和對照組劃痕面積百分比分別為0.182±0.025 4、0.303±0.036 4，2組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.811，P=0.022 8）；24 h時，實驗組和對照組劃痕面積百分比分別為0.271±0.033 2、0.481±0.045 6，2組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.821，P=0.005 1）；36 h時，實驗組和對照組劃痕面積百分比分別為0.340±0.045 5、0.623±0.076 0，2組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.392，P=0.009 5）（圖5）。

在Transwell實驗中，16 h時，實驗組和對照組細(xì)胞遷移數(shù)分別為9.875±0.875 0、15.50 ±1.626 0，2組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.047，P=0.008 7）；24 h時，實驗組和對照組細(xì)胞遷移數(shù)分別為20.80±3.308、39.40±4.238，2組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.460，P=0.008 6）（圖6）。

2.6 FGFRL1 siRNA干擾處理細(xì)胞對于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白的影響

將FGFRL1 siRNA轉(zhuǎn)染的HN4細(xì)胞作為實驗組，將NC siRNA處理的HN4細(xì)胞作為對照組。實驗組較對照組FGFRL1蛋白表達(dá)量下降，神經(jīng)性鈣黏附素蛋白及波形蛋白表達(dá)量下降，上皮鈣黏附素蛋白表達(dá)量上升（圖7）。

圖 5 細(xì)胞劃痕實驗檢測沉默F(xiàn)GFRL1對HN4細(xì)胞遷移能力的影響 倒置顯微鏡 × 100Fig 5 Scratch test to detect the effect of silent FGFRL1 on the migration ability of HN4 cells inverted microscope × 100

圖 6 轉(zhuǎn)染24 h后，2組細(xì)胞Transwell遷移實驗結(jié)果 倒置顯微鏡 × 400Fig 6 Transwell migration results of cells in two groups after trans-fectioned 24 hours inverted microscope × 400

3 討論

FGFR是免疫球蛋白基因超家族成員，通過與成纖維生長因子相結(jié)合，經(jīng)過一系列的信號傳遞對細(xì)胞增殖、分化等進(jìn)行調(diào)節(jié)[4]。FGFRL1作為FGFR家族中第5個成員，在多種生物學(xué)活動方面都有重要作用，如抑制血管形成[14]、抑制DNA合成和細(xì)胞增殖作用等[15]。FGFRL1不僅影響細(xì)胞增殖及分化，在器官的生長發(fā)育中也起了重要作用，Gerber等[14]發(fā)現(xiàn)FGFRL1受體對于小鼠的腎臟發(fā)育至關(guān)重要。FGFRL1也廣泛表達(dá)在軟骨、發(fā)育中的骨組織、舌部的肌肉、胰腺以及肺等組織中[16-17]。

圖 7 2組細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果Fig 7 Western blot analysis of cells in two groups

目前有關(guān)FGFRL1在腫瘤方面的研究較少。Chen等[18]研究顯示FGFRL1在小細(xì)胞肺癌樣本中出現(xiàn)過表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)FGFRL1表達(dá)水平與小細(xì)胞肺癌患者的臨床分期、化療反應(yīng)和生存時間具有相關(guān)性。FGFRL1高表達(dá)患者，其惡性程度高，化療耐藥性強(qiáng)，預(yù)后較差。Tsuchiya等[19]發(fā)現(xiàn)FGFRL1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)FGFRL1在OCSS中的報道。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFRL1蛋白在OSCC組織中的表達(dá)量高于癌旁正常組織，在OSCC細(xì)胞株中的表達(dá)量高于正常上皮細(xì)胞。FGFRL1顯示在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位。一些研究人員假設(shè)，F(xiàn)GFRL1與FGF家族的生長因子相互作用時，由于缺少細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，因此無法通過磷酸化發(fā)出信號，從而對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用[20-21]。Tsuchiya等[19]發(fā)現(xiàn)FGFRL1通過將細(xì)胞周期阻斷在G1/G0期以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，MiR-210可通過靶向作用于FGFRL1，發(fā)揮其腫瘤抑制作用[22]。但在本次細(xì)胞實驗中，發(fā)現(xiàn)FGFRL1基因沉默對OSCC細(xì)胞（HN4）增殖無明顯影響，同時用CAl27細(xì)胞株進(jìn)行驗證，CCK-8實驗檢測2組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞增殖活力無明顯差異。腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是造成患者預(yù)后較差的重要因素，Takei等[12]研究發(fā)現(xiàn)在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞實驗中，經(jīng)FGFRL1基因敲除的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞（FGFRL1-KO KYSE520）的遷移率較野生型食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞（Wild-type KYSE520）低?；贠SCC細(xì)胞遷移在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究探討了FGFRL1對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)OSCC細(xì)胞經(jīng)FGFRL1基因沉默后，OSCC細(xì)胞遷移水平降低，提示FGFRL1在腫瘤細(xì)胞遷移中可能起到促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用。同樣的，用CAl27細(xì)胞株進(jìn)行驗證，細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染36 h后細(xì)胞遷移率，實驗組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

EMT在癌癥的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中具有非常重要的作用[23-26]。在OSCC進(jìn)展中，EMT可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子，破壞細(xì)胞間的正常黏附，導(dǎo)致細(xì)胞間結(jié)合喪失，獲得間質(zhì)細(xì)胞表型，降解基底細(xì)胞膜，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞浸潤和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移傳播[27]。EMT的典型特征是上皮鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，波形蛋白和神經(jīng)鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)[28-29]。本研究中，在HN4細(xì)胞中沉默F(xiàn)GFRL1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HN4細(xì)胞上皮鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，神經(jīng)鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)下調(diào)，提示FGFRL1可能在OSCC進(jìn)展中誘導(dǎo)EMT過程的發(fā)生。

本研究表明，F(xiàn)GFRL1蛋白在OSCC組織中的表達(dá)量高于癌旁正常組織，在OSCC細(xì)胞株中的表達(dá)量高于正常上皮細(xì)胞。FGFRL1基因沉默對OSCC細(xì)胞增殖并不產(chǎn)生影響，對OSCC細(xì)胞遷移具有抑制作用。FGFRL1有可能成為判斷OSCC患者預(yù)后的一個重要生物學(xué)指標(biāo)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。