羅瑜雪 孫蔓琳 施培磊 劉盼 陳藝尹 彭顯

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，成都 610041

1898年，法國(guó)微生物學(xué)家Veillon和Zuber從人的感染闌尾中首次分離出一種革蘭陰性專性厭氧球菌，1933年，Prévot將之命名為“Veillonella parvula”，之后韋榮球菌屬下的各韋榮球菌種被科學(xué)家們陸續(xù)分離得到。韋榮球菌屬是口腔微生態(tài)的重要成員之一，除了口腔，韋榮球菌也存在于人類上呼吸道、腸道和陰道等位置。有研究[1]顯示，健康成人唾液、牙菌斑中韋榮球菌豐度僅次于鏈球菌。目前報(bào)道過(guò)的韋榮球菌共有14種，其中有7種可從人口腔中分離得到：小韋榮菌（Veillonella parvula，V. parvula）、殊異韋榮菌（Veillonella dispar，V. dispar）、非典型韋榮菌（Veillonella atypica，V. atypica）、Veillo-nella rogosae、Veillonella denticariosi、Veillonellatobetsuensis、Veillonella infantium[2-5]。由于具有相似的生化特性和表型特征，韋榮球菌種類的鑒別目前主要是基于16S rDNA、dnaK、rpoB和gltA等基因的差異[6-7]。在人口腔中，韋榮球菌主要分布于唾液、舌黏膜及頰黏膜、牙齦及齦溝，不同種韋榮球菌的分布存在一定差異。Doel等[8]分析樣本后發(fā)現(xiàn)了V.atypica的檢出率為舌面>唾液>牙菌斑，V. dispar的檢出率為舌面>唾液，V. parvula在牙菌斑中檢出率最高。V. dispar主要在口腔衛(wèi)生指標(biāo)良好或社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位高者口腔內(nèi)檢出[9]；V. parvula在兒童中檢出最頻繁，而嚴(yán)重的早發(fā)性孩童期齲齒與V. atypica有關(guān)[10]；牙周袋中V. parvula的檢出率比在牙齦溝中更高，與慢性牙周炎有關(guān)[11]。地區(qū)、年齡、吸煙、飲食、口腔衛(wèi)生及患病情況等影響因素也會(huì)造成菌種分布的差異[12-14]。韋榮球菌不能代謝碳水化合物和多元醇，但能利用短鏈有機(jī)酸，特別是利用乳酸作為能源，轉(zhuǎn)化為酸性較弱的乙酸和丙酸?？谇豁f榮球菌因其代謝乳酸可降低pH的特性曾被認(rèn)為是防齲的益生菌，后多項(xiàng)研究[15-16]表明，口腔韋榮球菌與齲病密切相關(guān)，可協(xié)同變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）致齲。除此之外，口腔韋榮球菌與牙髓、根尖周感染以及慢性牙周炎等口腔疾病也有一定關(guān)系。因此，韋榮球菌屬在口腔微生態(tài)中的作用及其與口腔疾病的相關(guān)性不容忽視。

1 韋榮球菌與齲病

齲病是在以細(xì)菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的一種疾病，鏈球菌屬為常見(jiàn)的致齲微生物之一。鏈球菌可分解碳水化合物產(chǎn)酸，使牙面局部pH下降造成脫礦而致齲，因此能利用其他細(xì)菌產(chǎn)生的乳酸而減少牙脫礦的韋榮球菌與齲病的關(guān)系值得探討。

1.1 韋榮球菌與齲病相關(guān)性的研究

關(guān)于韋榮球菌屬在齲病與非齲病人群口腔中的分布情況仍存在爭(zhēng)議。有關(guān)于根面齲、乳牙齲等的研究[10,17]認(rèn)為，韋榮球菌屬在齲病組中的豐度和檢出率高于無(wú)齲組，是齲病的優(yōu)勢(shì)菌之一；然而有研究[18-19]則得出相反結(jié)論，也有實(shí)驗(yàn)[20-21]證明，其豐度無(wú)顯著差別。Tanner等[21]則發(fā)現(xiàn)，V. parvula在嚴(yán)重兒童齲的樣本中檢出率顯著高于無(wú)齲組，而V. dis-par在無(wú)齲組的檢出率顯著高于嚴(yán)重兒童齲組。綜上，近來(lái)的研究[22]更傾向于認(rèn)為，韋榮球菌屬在齲病發(fā)生發(fā)展中有重要作用，其與鏈球菌屬在生物膜形成過(guò)程中的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)代謝、細(xì)菌間共聚集及其他黏附現(xiàn)象、環(huán)境因素等方面的相互作用不可忽視。Guggenheim等[23]觀察到在生物膜形成過(guò)程中，V. dispar發(fā)生了形態(tài)上的轉(zhuǎn)變，由在整個(gè)生物膜中稀疏散布的單個(gè)球菌和大多數(shù)小球狀小菌落，到不存在單細(xì)胞且大多數(shù)小菌落是細(xì)長(zhǎng)細(xì)胞橋連接而成的大扁圓結(jié)構(gòu)。Kara等[24]發(fā)現(xiàn)，S. mutans及V. par vula雙菌種生物膜中的細(xì)菌會(huì)聚集成距離小于1.2 μm的空間排列。在口腔內(nèi)唾液流動(dòng)的環(huán)境中，鏈球菌的黏附為韋榮球菌提供了位點(diǎn)，當(dāng)鏈球菌不存在，韋榮球菌則不能附著并生長(zhǎng)[25]。許多研究[15,25-26]也通過(guò)鏈球菌與韋榮球菌的雙菌種生物模型反復(fù)驗(yàn)證了，韋榮球菌的存在能促進(jìn)S. mutans、戈登鏈球菌（Strep-tococcus gordonii，S. gordonii）及唾液鏈球菌（Strep-tococcus salivarius，S. salivarius）生物膜的形成，而與口腔鏈球菌（Streptococcus oralis，S. oralis）及血鏈球菌（Streptococcus sanguinis，S. sanguinis）的生長(zhǎng)無(wú)關(guān)甚至抑制。

1.2 韋榮球菌與鏈球菌的相互作用

S. mutans、S. gordonii、韋榮球菌這3種菌種的相互作用涉及多個(gè)層面（圖1）。S. gordonii可以通過(guò)產(chǎn)生H2O2抑制S. mutans的生長(zhǎng)，而S. mutans產(chǎn)生細(xì)菌素抑制S. gordonii[27]，V. parvula參與的生物膜形成則能減少H2O2對(duì)S. mutans的抑制[28]，Zhou等[29]將V. parvulaPK1910的過(guò)氧化氫酶基因（catA）整合到V. atypicaOK5，證實(shí)了catA基因產(chǎn)物能保護(hù)具核梭桿菌在S. gordonii產(chǎn)生的H2O2環(huán)境下生長(zhǎng)的猜想。Liu等[27]通過(guò)向S. mutans與S. gordonii雙菌種模型中加入V. parvula，S. mutans生長(zhǎng)速率和最終生物量的增加證明了V. parvula能平衡兩者的競(jìng)爭(zhēng)。鏈球菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生的有機(jī)酸可作為韋榮球菌的碳源，V. dispar和V. atypica是口腔中硝酸鹽還原細(xì)菌的重要組成部分[30]，有助于硝酸鹽轉(zhuǎn)化成抑制齲洞中產(chǎn)酸細(xì)菌生長(zhǎng)的還原產(chǎn)物[31]。V. atypicaPK1910與相對(duì)分子質(zhì)量為4.5×104的蛋白有關(guān)的黏附素、V.atypicaOK5的表面蛋白血凝素（hemagglutinin，Hag）1，S. gordonii的表面黏附素Hsa均可介導(dǎo)兩者的屬間共聚集[32-34]，而V. tobet suensis產(chǎn)生的環(huán)狀二肽會(huì)抑制S. gordonii生物膜的形成[35]，Egland等[36]和Johnson等[37]則觀察到S. gordonii與V. atypicaPK1910之間有特異性可擴(kuò)散信號(hào)傳導(dǎo)現(xiàn)象，由于轉(zhuǎn)錄因子CcpA的誘導(dǎo)作用，V. atypica使S. gordonii的α 淀粉酶amyB基因的淀粉酶產(chǎn)物活性增加，促進(jìn)糖原水解，提高碳水化合物利用率和乳酸生成量，有助于細(xì)菌生長(zhǎng)。

2 韋榮球菌與牙周病

牙周病是發(fā)生在牙的支持組織的疾病，主要臨床癥狀是牙齦出血、牙槽骨吸收、牙周袋形成、牙齒松動(dòng)，牙菌斑生物膜是牙周病的一個(gè)最重要致病因素，牙周病是牙菌斑微生態(tài)失衡使牙周致病菌成為優(yōu)勢(shì)菌群的結(jié)果。較牙周健康人群來(lái)說(shuō)，牙周病患者口腔中韋榮球菌豐度顯著增高[38]。

圖 1 S. mutans、S. gordonii、韋榮球菌的相互作用Fig 1 The internaction between S. mutans, S. gordonii and Veillonella

2.1 韋榮球菌直接參與牙周病的進(jìn)展

通過(guò)調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞[39]等免疫細(xì)胞的功能及炎癥介質(zhì)反應(yīng)[40]，微生物可影響牙周炎的發(fā)生發(fā)展。Hirschfeld等[41]通過(guò)研究人外周血中性粒細(xì)胞對(duì)19種牙周菌斑優(yōu)勢(shì)菌的反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，牙周炎組織損傷可能是由牙菌斑誘導(dǎo)的細(xì)胞外活性氧釋放過(guò)多引起的，活性氧雖然有助于微生物的殺滅，但其卻并不能區(qū)分病原體和宿主組織。研究還提示，中性粒細(xì)胞在牙周細(xì)菌刺激下，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和超氧化物釋放，且具有物種特異性，與其他微生物相比，V. parvula能刺激更高水平的中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)和活性氧的釋放。Ji等[42]在研究非牙周致病菌與牙周致病菌對(duì)牙齦上皮細(xì)胞先天免疫應(yīng)答的影響中發(fā)現(xiàn)，作為非牙周致病菌的V. atypica可顯著誘導(dǎo)牙齦上皮細(xì)胞產(chǎn)生一種在炎癥或感染狀態(tài)下才產(chǎn)生的廣譜抗菌肽，即人β防御素-3（human beta defensin-3，HBD-3）。此外，韋榮球菌具有強(qiáng)毒性內(nèi)毒素，可能通過(guò)引起非特性免疫反應(yīng)參與牙周病的進(jìn)展[43]，其脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也被證明可通過(guò)介導(dǎo)前列腺素E2生成而促進(jìn)骨的吸收[44]。

2.2 韋榮球菌協(xié)同牙齦卟啉單胞菌影響牙周病的發(fā)生發(fā)展

韋榮球菌作為“橋接菌”，附著于早期定植菌后，吸附中、晚期定植菌。牙齦卟啉單胞菌（Por-phyromonas gingivalis，P. gingivalis）是公認(rèn)的牙周致病菌[45]，也是晚期定植菌，韋榮球菌與P. gingivalis在形成生物膜過(guò)程中的協(xié)同作用[46]與二者間的黏附密切相關(guān)。一方面，韋榮球菌可為P. gingivalis提供黏附位點(diǎn)。Zhou等[34]研究發(fā)現(xiàn)V. atypica表面存在一種蛋白Hag1，可以介導(dǎo)韋榮球菌與P. gingivalis的黏附。Hag1是韋榮球菌第一個(gè)被證實(shí)的表面蛋白，為目前已知最大的Hag基因。Hag1可以介導(dǎo)韋榮球菌與一些早期定植菌如S. gordonii等的聚集，以及晚期定植菌如P. gingivalis等的黏附[47]。Hag1基因位于單基因操縱子上，編碼蛋白為三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由頭、頸、體、膜錨定域4部分組成，頭部形成淺口袋形的受體結(jié)合域，頸部具有彈性連接頭部與體部，體部借錨定域錨定在外膜上（圖2A）。Eke等[48]曾得到韋榮球菌與P. gingivalis的黏附受乳糖、半乳糖抑制的結(jié)論，由此推斷其黏附機(jī)制包括糖結(jié)合作用，且可能受菌種、菌液的密度標(biāo)準(zhǔn)、加入乳糖的順序、加入乳糖的量、允許兩菌反應(yīng)的時(shí)間長(zhǎng)度影響。Zhou等[34]發(fā)現(xiàn)，乳糖、半乳糖處理對(duì)V. atypica與P. gingi-valis的黏附無(wú)影響。Park等[49]研究表明，血清型、菌株特異性的黏附在口腔菌群間十分常見(jiàn)，即韋榮球菌、P. gin givalis不同亞型之間的相互黏附均有差異，可分為乳糖敏感性及非乳糖敏感型。S. gordonii通過(guò)唾液酸結(jié)合性蛋白（sialic acid-binding adhesin，Hsa）與韋榮球菌表面蛋白Hag1結(jié)合黏附[33-34]，P.gingivalis表面與Hag1的結(jié)合受體仍未知，而胎球蛋白能夠在一定程度上抑制韋榮球菌與P. gingivalis的黏附，證明其黏附機(jī)制中包括唾液酸結(jié)合作用（圖2B）。

另一方面，韋榮球菌可以為P. gingivalis提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。Zhou等[50]在V. atypica的細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到氯化血紅素及其相關(guān)產(chǎn)物，表明存在氯化血紅素生物合成途徑，他們還證明了韋榮球菌通過(guò)提供P.gingivalis生長(zhǎng)所必需的氯化血紅素促進(jìn)其生長(zhǎng)，P.gingivalis又可使韋榮球菌的氯化血紅素合成表達(dá)上調(diào)。在組成成分不包含氯化血紅素的培養(yǎng)基中無(wú)法存活的P. gingivalis，加入滅活氯化血紅素合成基因的V. atypica后數(shù)量可倍增，說(shuō)明韋榮球菌還可通過(guò)其他途徑促進(jìn)P. gingivalis生長(zhǎng)，亟待進(jìn)一步研究。此外，V. parvula對(duì)四環(huán)素等牙周炎常用抗菌藥物具有天生抗性[51]，生物膜中韋榮球菌的存在降低其對(duì)抗菌素的敏感性。

3 韋榮球菌與其他口腔疾病

牙髓和根尖周病變中頻繁檢出韋榮球菌[52]，多為V. parvula，韋榮球菌致病性可能與其產(chǎn)生的LPS有關(guān)，LPS能夠激活機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)[53]，持續(xù)釋放促炎癥因子。對(duì)于其引起根尖周病變的免疫潛力方面，有研究發(fā)現(xiàn)，V. parvula蛋白和LPS均對(duì)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，能顯著增強(qiáng)人外周血單核細(xì)胞遷移活性[54]，且V. parvula產(chǎn)生的LPS是人外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的弱刺激因子[55]。牙髓及根尖周感染通常為混合感染，韋榮球菌和其他細(xì)菌之間的相互作用也不容忽視，V. parvula能夠產(chǎn)維生素K2供卟啉單胞菌屬和普雷沃菌屬利用[56]。此外，V. parvula在與牙密螺旋體的共培養(yǎng)中能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)[57]。

圖 2 V. atypica與S. gordonii、P. gingivalis的相互作用Fig 2 The internaction between V. atypica, S. gordonii and P. gingivalis

口臭的主要來(lái)源是口腔內(nèi)細(xì)菌代謝產(chǎn)生的H2S等含硫化合物，該過(guò)程受到口腔環(huán)境因素pH和乳酸的調(diào)節(jié)。韋榮球菌可通過(guò)分解L-半胱氨酸產(chǎn)H2S[58]，Washio等[59]的研究發(fā)現(xiàn)，口腔中脫落細(xì)胞中的主要蛋白質(zhì)——角蛋白，可以作為L(zhǎng)-半胱氨酸在口腔中的來(lái)源，而位于細(xì)胞質(zhì)中的多種酶參與了其代謝過(guò)程，而關(guān)于韋榮球菌產(chǎn)生H2S的具體酶和通路仍不明確；他們還發(fā)現(xiàn)，乳酸的存在可以通過(guò)激活L-半胱氨酸降解前的過(guò)程，如細(xì)胞膜上L-半胱氨酸的攝取，來(lái)顯著提高韋榮球菌靜息細(xì)胞H2S生成量，并且在pH=6～7時(shí)，H2S生成量較高，pH=5時(shí)，H2S生成量較低。已有研究[60]證明，由產(chǎn)堿韋榮球菌（Veillo-nella alcalescens）產(chǎn)生的膜泡具有對(duì)谷氨酸和絲氨酸的攝取活性，并伴有乳酸作為電子供體參與電子傳遞系統(tǒng)。韋榮球菌是否可通過(guò)類似的系統(tǒng)影響H2S的產(chǎn)生還有待進(jìn)一步研究。

4 韋榮球菌分子機(jī)制的研究進(jìn)展

韋榮球菌曾經(jīng)由于基因改造、遺傳操作的困難，是人類口腔微生物群中最普遍但研究最少的微生物之一。而Liu等[61]通過(guò)電穿孔成功將靶向突變引入到V. parvulaPK1910的染色體中，第一次驗(yàn)證了韋榮球菌的可轉(zhuǎn)化性。但是轉(zhuǎn)化效率較低，因此，他們又基于韋榮球菌的內(nèi)源質(zhì)粒構(gòu)建了第一個(gè)大腸桿菌-韋榮球菌穿梭載體，開(kāi)發(fā)了第一個(gè)遺傳可轉(zhuǎn)化菌株V. atypicaOK5[62]，并測(cè)定了完整基因組序列[63]。但是在下游基因不產(chǎn)生極性效應(yīng)的情況下，單交叉誘變系統(tǒng)不能在多基因操縱子中產(chǎn)生突變，因此，他們?cè)俅卫肰. atypica建立了第一個(gè)反向無(wú)標(biāo)記誘變系統(tǒng)[64]，這樣的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不僅可以用于基因缺失研究，還可以用于插入序列。由于通過(guò)電穿孔的等位基因交換突變已經(jīng)被證實(shí)是無(wú)效的，Knapp等[65]驗(yàn)證了V. parvula菌株等位基因置換突變的自然轉(zhuǎn)化能力較常見(jiàn)。Zhou等[33-34]利用該遺傳可轉(zhuǎn)化菌株V.atypicaOK5鑒定出Hag1黏附素參與韋榮球菌與鏈球菌、P. gingivalis和人體頰細(xì)胞的分子識(shí)別、共聚集過(guò)程；并證明了存在促進(jìn)牙周病原體生長(zhǎng)的血紅素生物合成途徑[50]；證實(shí)了韋榮球菌的catA基因產(chǎn)物過(guò)氧化氫酶能保護(hù)具核梭桿菌等其他細(xì)菌在H2O2環(huán)境的生長(zhǎng)[29]。韋榮球菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立為韋榮球菌在口腔生物膜形成中的橋接作用及疾病防治的研究提供新的思路，有利于深入了解人類口腔生物膜的生態(tài)學(xué)。

5 總結(jié)

綜上所述，韋榮球菌與齲病、牙周病、牙髓及根尖周病、口臭等口腔疾病存在相關(guān)性，但在分子水平上的具體機(jī)制仍不夠清楚。齲病方面，早期認(rèn)為可利用乳酸減少牙脫礦的韋榮球菌有防齲作用，盡管針對(duì)齲病患者口腔韋榮球菌的分布情況仍無(wú)統(tǒng)一定論，但目前研究更傾向于認(rèn)可韋榮球菌在致齲過(guò)程中發(fā)揮重要作用，由于其與鏈球菌屬間的共聚集和黏附、并能促進(jìn)形成生物膜，以及在代謝方面有協(xié)同生長(zhǎng)作用，而其與鏈球菌的具體黏附方式及促進(jìn)鏈球菌生物膜形成的機(jī)制尚不清楚。牙周病方面，韋榮球菌通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的中性粒細(xì)胞和釋放活性氧、為牙周致病菌提供黏附位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源參與牙周病的進(jìn)展，但與P. gingivalis表面的結(jié)合位點(diǎn)仍不明確，也需要進(jìn)一步研究促進(jìn)P. gingivalis生長(zhǎng)的其他代謝途徑?？谇患膊∈嵌喾N微生物、多因素共同作用的結(jié)果，目前韋榮球菌與致病菌在某些方面的協(xié)同關(guān)系已被證實(shí)，其在分子水平上影響口腔疾病的具體機(jī)制、是否促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展仍需要進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。