膿毒血癥患者急性肺損傷的差異基因表達(dá)分析

余彪 閆志國(guó) 干堯鳘

1四川大學(xué)華西醫(yī)院眉山醫(yī)院 眉山市人民醫(yī)院急診科620010;2昆明市第一人民醫(yī)院胸外科650011

膿毒血癥作為臨床醫(yī)學(xué)較為常見的疾病之一,是一種由感染誘發(fā)的一系列病理、生理以及生化異常的綜合征。其發(fā)病原因可能與下列因素有關(guān):常發(fā)生于患有嚴(yán)重疾病或外傷的患者 (如嚴(yán)重?zé)齻?、多發(fā)傷、外科手術(shù)后以及重癥肺炎等患者),還可常見于伴有慢性病或免疫力低下者(如糖尿病、白血病以及再生障礙性貧血等)[1-2]。寒戰(zhàn)、高熱、咳嗽、胸痛以及意識(shí)障礙等是膿毒血癥的主要臨床表現(xiàn),部分患者還會(huì)伴有水電解質(zhì)紊亂、應(yīng)激性潰瘍、酸堿平衡失調(diào)等病癥[3-4]。膿毒血癥的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,是從分子水平到器官水平多因素相互作用形成的結(jié)果,其發(fā)病機(jī)制可能為:(1)病原體的外源性因子和損傷細(xì)胞釋放的內(nèi)源性因子均可與機(jī)體的模式識(shí)別受體相互作用;(2)膿毒血癥炎癥與凝血的相互影響;(3)免疫細(xì)胞的自我程序性死亡;(4)機(jī)體在受到感染刺激后大量炎性介質(zhì)的釋放。有明確的感染病灶、存在組織灌注不良表現(xiàn)(如急性意識(shí)障礙等)、降鈣素原以及反應(yīng)蛋白超過正常值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差等是其主要診斷依據(jù)。膿毒血癥嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致器官功能障礙或循環(huán)障礙,危及生命安全,常伴有急性肺損傷 (acute lung injury,ALI),其預(yù)后效果較差,具有高病死率等特點(diǎn)[5]。隨著生活、交通方式的快速轉(zhuǎn)變,膿毒血癥合并ALI的發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[6],嚴(yán)重威脅著人們的身心健康,因此積極尋求一種有效治療膿毒血癥合并ALI的方式尤為重要。近年來,我國(guó)現(xiàn)代生物信息技術(shù)的快速發(fā)展 (如基因芯片等)為全面研究膿毒血癥合并ALI發(fā)病機(jī)制提供了新的技術(shù)手段[7-9]。因此,本研究借助生物信息學(xué)對(duì)膿毒血癥合并ALI的差異基因進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 一般資料 本文患者資料來源為美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心公共數(shù)據(jù)庫,患者為匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心ICU 中的13 例膿毒血癥合并ALI患者和21例單純膿毒血癥患者。每例患者入院后48 h內(nèi)取全血,提取RNA 進(jìn)行基因表達(dá)譜分析和比較分析。

1.2 基因芯片GSE10474數(shù)據(jù)集的下載 本研究首先從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心公共數(shù)據(jù)平臺(tái)GEO 下載基因芯片GSE10474 數(shù)據(jù)集,其中包括13例膿毒血癥合并ALI患者和21例單純膿毒血癥患者,下載完成后借助limma包對(duì)上述所查詢出的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 差異靶點(diǎn)基因的篩選及其數(shù)據(jù)處理 為篩選膿毒血癥和ALI的有效靶點(diǎn)基因,本研究利用貝葉斯算法對(duì)2組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析。設(shè)置差異的條件如下:logFC 絕對(duì)值＞0.5,P ＜0.05,所得出的差異基因用火山圖進(jìn)行可視化處理。為了明確前10個(gè)差異基因的表達(dá)情況,本研究結(jié)合樣本表達(dá)量進(jìn)行組間T 檢驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行分析。

1.4 GO 富集及KEGG 通路的分析 借助R 的ClusterProfile包對(duì)前10個(gè)差異基因進(jìn)行GO 富集分析(主要用于注釋差異基因的生物學(xué)過程)以及KEGG 通路的分析 (主要用于了解其相關(guān)的信號(hào)通路)。

1.5 差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)以及網(wǎng)絡(luò)中核心驅(qū)動(dòng)基因的分析 將上述得到的差異基因使用string數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行處理,設(shè)置可信度為0.4,則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,之后便得出蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖,借助cytoscape軟件篩選出核心驅(qū)動(dòng)基因,并對(duì)其進(jìn)行可視化圖形處理。

2 結(jié)果

2.1 GSE10474數(shù)據(jù)集中2組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化前后結(jié)果的對(duì)比 結(jié)果顯示,在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化之前,數(shù)據(jù)基線較為紊亂;而在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化之后,所有數(shù)據(jù)基線基本趨于一致。見圖1。

2.2 差異基因的篩選及其數(shù)據(jù)處理結(jié)果 本研究共篩選出73個(gè)差異基因,其中45個(gè)為上調(diào)基因,28個(gè)為下調(diào)基因,并對(duì)其進(jìn)行可視化處理(圖2)。前10個(gè)差異基因的結(jié)果如表1所示,上調(diào)基因分別為BTNL8、CDKN1A、TREM1、TAK1 以及H4FH,下調(diào)基因分別為 CYBRD1、HOPX、UPB1、NME8以及FAR2。結(jié)果顯示,前10個(gè)差異基因在2組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

2.3 差異基因GO 富集及其KEGG 通路的分析結(jié)果 對(duì)差異基因進(jìn)行了GO 富集分析后,可見這些差異基因主要富集在反式高爾基網(wǎng)絡(luò)膜、細(xì)胞膜腔側(cè)以及IRE1 介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)等 (表2);KEGG 通路分析顯示主要集中的信號(hào)有3 條,即ZAP-70酪氨酸激酶、CD3和TCR Zeta鏈的磷酸化以及PD-1信號(hào)通路(表3)。

2.4 差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 為查找膿毒血癥合并ALI相關(guān)的核心驅(qū)動(dòng)基因,本研究構(gòu)建了差異基因蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示,共構(gòu)建34個(gè)節(jié)點(diǎn) (圖4),其核心驅(qū)動(dòng)基因共構(gòu)建10個(gè)節(jié)點(diǎn) (圖5),按照互作關(guān)系從多到少的原則,初步確定了FCGR2B、HLA-DQB1、HLA-DRA、CD74、CD86、CD4、SEC31A 這7 個(gè)基因,這7個(gè)基因與其他基因存在較強(qiáng)的互作關(guān)系。

3 討論

圖1 34個(gè)樣本數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化前后結(jié)果的對(duì)比 A:標(biāo)準(zhǔn)化之前;B:標(biāo)準(zhǔn)化之后

表1 前10個(gè)差異基因

圖2 差異基因可視化處理 (火山圖)

膿毒血癥是由感染因素所引起的全身反應(yīng)綜合征,又是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、感染以及外科大手術(shù)等常見的并發(fā)癥,按其嚴(yán)重程度可分為膿毒血癥、嚴(yán)重膿毒血癥和膿毒血癥休克[9]。膿毒血癥患者若未得到及時(shí)治療,不僅嚴(yán)重影響患者的生活水平,與此同時(shí)還會(huì)增加其心理負(fù)擔(dān)。目前在臨床工作中,該病的治療方式主要為藥物治療及其他治療(如抗休克治療等),該病具有高發(fā)病率、高病死率以及預(yù)后較差等特點(diǎn)[10-11]。生物信息學(xué)是生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)以及信息工程等所形成的一門綜合性學(xué)科,主要是應(yīng)用生物算法和相關(guān)的軟件工具采集、處理、分析和解釋生物數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)可有效挖掘在疾病發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮作用的核心驅(qū)動(dòng)基因,這為疾病發(fā)病機(jī)制的研究指明了方向[12-13]。膿毒血癥合并ALI作為臨床中的常見病,近年來很多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了多種藥物治療的研究,但仍沒取得理想的治療效果且其發(fā)病尚未被闡明[14]。膿毒血癥患者由于感染原因,容易導(dǎo)致肺功能降低和氣體交換失衡,從而導(dǎo)致ALI,為進(jìn)一步揭示膿毒血癥合并ALI的發(fā)病機(jī)制提供新的方向。本研究利用生物信息學(xué)篩選與疾病相關(guān)的基因,為尋找該病治療的新靶點(diǎn)提供一定的理論支持。在本研究中,上調(diào)基因分別為BTNL8、CDKN1A、TREM1、TAK1以及H4FH。B7家族分子在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中的作用已得到充分證明,B7 家族中的BTNL8 可在體外增加T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。有研究表明BTNL8可能在T 淋巴細(xì)胞的初次啟動(dòng)中起著重要作用,可共同刺激初次免疫反應(yīng)[15]。CDKN1A 是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A,有研究表明在肺損傷大鼠模型中,CDKN1A 表達(dá)上調(diào)[16]。TREM1是一種新型炎癥激發(fā)受體,是已知的炎癥放大器。有研究表明,在肺組織中TREM1通過增強(qiáng)Ki-67、PCNA 和Ang-1蛋白表達(dá),提高肺的修復(fù)能力,對(duì)肺損傷模型顯示有益[17]。TAK1是一種激酶,與有絲分裂激活的蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān),是許多信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),對(duì)免疫反應(yīng)起著至關(guān)重要的作用。Cheng等[18]在對(duì)小鼠進(jìn)行支氣管肺泡灌洗后,提取了小鼠原代巨噬細(xì)胞建立TAK1敲除模型,研究結(jié)果表明巨噬細(xì)胞中TAK1可能是肺炎的觸發(fā)因素。H4FH 即Official Symbol的H4C8,有研究表明,H4C8具有提高人源化抗體的免疫原性,并且對(duì)人類是安全的、耐受性良好的[19]。CYBRD1是一種在十二指腸表皮細(xì)胞中高表達(dá)的靶基因,具有調(diào)節(jié)鐵元素的吸收、促進(jìn)細(xì)胞的損傷修復(fù)的功能。孟必成等[20]的研究表明,CYBRD1下調(diào)對(duì)小鼠模型具有促進(jìn)修復(fù)的作用。HOPX 基因是一種磷酸組蛋白,在肺泡細(xì)胞代償性再生長(zhǎng)的過程中,可增殖雙向分化形成新的肺泡,HOPX 是肺發(fā)育的重要調(diào)節(jié)劑,肺泡細(xì)胞損傷后,HOPX 分化Ⅰ型成熟的上皮肺泡細(xì)胞,并自我更新產(chǎn)生成熟的Ⅱ型上皮肺泡細(xì)胞,對(duì)肺組織的修復(fù)具有可塑作用[21]。

圖3 前10個(gè)差異基因的表達(dá)情況 A:BTNL8表達(dá);B:CDKN1A 表達(dá);C:TREM1表達(dá);D:TAK1表達(dá);E:H4FH 表達(dá);F:CYBRD1表達(dá);G:HOPX 表達(dá);H:UPB1表達(dá);I:NME8表達(dá);J:FAR2表達(dá)

在本研究中,通過對(duì)13例膿毒血癥合并ALI患者和21例膿毒血癥患者數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,其結(jié)果顯示與標(biāo)準(zhǔn)化處理前比較,2組的基線基本趨于一致,對(duì)2組數(shù)據(jù)共篩選出73個(gè)差異基因,包括45個(gè)上調(diào)基因和28個(gè)下調(diào)基因,前10個(gè)差異基因分布中,BTNL8、CDKN1A、TREM1、TAK1、H4FH 為上調(diào)基因,CYBRD1、HOPX、UPB1、NME8、FAR2為下調(diào)基因,且上述差異基因在膿毒血癥患者和膿毒血癥合并ALI患者中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO 富集分析可見這些差異基因主要富集在反式高爾基網(wǎng)絡(luò)膜、細(xì)胞膜腔側(cè)以及IRE1介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)中。KEGG 分析其通路信號(hào)有3條,即ZAP-70酪氨酸激酶、CD3和TCR Zeta 鏈的磷酸化以及PD-1 信號(hào)通路。string數(shù)據(jù)庫和cytoscape軟件分析發(fā)現(xiàn)FCGR2B、HLA-DQB1、HLA-DRA、CD74、CD86、CD4、SEC31A 與其他基因存在較強(qiáng)的互作關(guān)系。

表2 差異基因功能富集分析

表3 差異基因Reactome通路富集分析

綜上,本研究初步篩選出73個(gè)差異基因,對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO 分析及KEGG 通路分析,初步明確了疾病的相關(guān)信號(hào)通路,此外通過構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖,其中7個(gè)核心驅(qū)動(dòng)基因在疾病發(fā)病中占有重要地位,為進(jìn)一步研究該病的作用機(jī)制提供一定方向。

圖4 差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖5 核心驅(qū)動(dòng)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突