許藝蘭，鐘丹丹，杜雪松，謝炎東，劉晶潔，孫 悅，賓石玉*

(1.珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西師范大學(xué))，廣西 桂林 541006；2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021)

羅非魚是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要品種和出口優(yōu)勢(shì)品種[1]，其耐寒能力較差，低溫影響羅非魚消化酶活性、生理生化指標(biāo)及肝、脾、鰓細(xì)胞形態(tài)[2-4]。在我國羅非魚的主要養(yǎng)殖區(qū)，每年冬春季節(jié)低溫造成羅非魚大量死亡，經(jīng)濟(jì)損失慘重[5]。低溫成為制約羅非魚產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要因素之一，因此，羅非魚耐寒品種選育至關(guān)重要。利用分子標(biāo)記技術(shù)篩選羅非魚耐寒相關(guān)候選基因及其與耐寒性狀相關(guān)的分子標(biāo)記,在輔助羅非魚耐寒品種的選育方面具有重要的意義[6-7]。

TCP-1-eta基因?qū)儆跓峒さ鞍?0(heat shock protein 60，HSP60)家族成員，存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，由60 ku單體組成的低聚物而形成，主要功能是參與機(jī)體熱應(yīng)激反應(yīng)，幫助多肽正確折疊和線粒體蛋白質(zhì)的運(yùn)輸，參與DNA的代謝等[8]。研究發(fā)現(xiàn)：TCP-1基因與生物體的耐寒能力有關(guān)，并證實(shí)可能對(duì)生物體的耐寒能力有一定影響[9-10]；南極抗凍魚的TCP-1基因在其低溫耐受性方面發(fā)揮作用[11]；低溫誘導(dǎo)下鯉魚TCP-1-eta基因的表達(dá)量增多[12]。因此，本文研究以羅非魚TCP-1基因作為耐寒性狀的候選基因，擬開展PCR-SSCP多態(tài)性分析及其與耐寒性能的相關(guān)性分析，為輔助羅非魚耐寒品種的選育提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚為體質(zhì)量5.5 g左右的吉富品系羅非魚，從國家級(jí)廣西南寧羅非魚良種場(chǎng)采購。

1.1.2 主要儀器

上海海圣制冷水循環(huán)系統(tǒng)(50 cm×50 cm ×50 cm)、廈門和譜儀器有限公司Centrifuge 5418離心機(jī)、格蘭仕WP800TL23-K3微波爐、北京六一儀器廠DYY-6C型電泳儀、24-17-PR凝膠成像系統(tǒng)、海爾BCD-250TF冰箱、三印(SANYWUN)探針筆式防水水溫電子溫度計(jì)等。

1.1.3 主要試劑

組織基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、pBR322/Msp I Maker均由天根生化科技有限公司提供，瓊脂糖、丙烯酰胺、顯色劑、EDTA-Na2、Tris Base等購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)羅非魚的篩選

選取2 000尾體質(zhì)量(5.5±0.5) g吉富羅非魚，分別隨機(jī)放入50 cm×50 cm ×50 cm編號(hào)為A、B、C、D的自動(dòng)制冷水循環(huán)水族箱中，每箱500尾為1組，進(jìn)行低溫脅迫實(shí)驗(yàn)：從水溫25 ℃開始，4個(gè)水族箱以0.33 ℃/h分別降溫到8、10、12和14 ℃，停止降溫并維持該溫度，仔細(xì)觀察并記錄實(shí)驗(yàn)魚的行為表現(xiàn)、昏迷和死亡情況。根據(jù)魚的死亡時(shí)間篩選實(shí)驗(yàn)羅非魚：不耐低溫組為死亡最快的16尾；耐低溫組為死亡最慢的16尾。分別取每箱不耐低溫組和耐低溫組16尾實(shí)驗(yàn)魚背鰭和尾鰭之間的肌肉，肌肉樣品用無水乙醇處理后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA的提取

采用組織基因組DNA提取試劑盒，按照使用說明書的方法和步驟，從羅非魚肌肉提取基因組DNA。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫(登錄號(hào)JQ797421)提供的TCP-1基因序列設(shè)計(jì)4對(duì)引物(表1)，交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 羅非魚TCP-1-eta基因PCR-SSCP分析所用引物Tab.1 Primers for PCR-SSCP analysis of TCP-1-eta gene of tilapia

1.2.4 PCR-SSCP擴(kuò)增的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

PCR反應(yīng)總體積50 μL，其中上下游引物(10 μmoL/L)各0.9 μL，樣品DNA 3.0 μL，2×Taq MasterMix(含染料) 30.0 μL，dH2O 13.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)后保存于4 ℃無菌水中。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的SSCP分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，具體檢測(cè)步驟參照文獻(xiàn)[3]的方法：首先量取3～4 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行點(diǎn)樣，接著300 V高壓電泳10 min，然后170 V恒定電壓電泳16 h檢測(cè)，最后染膠并拍照保存。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

TCP-1-eta基因的等位基因數(shù)、等位基因頻率、基因型頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)計(jì)算均使用Popgene 1.32軟件?；蛐团c耐寒性狀的關(guān)聯(lián)性分析使用SPSS 15.0軟件，P>0.05表示差異性不顯著，P<0.05表示顯著性差異，P<0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增與SSCP分析

用所設(shè)計(jì)的4對(duì)引物TCP1-1、TCP1-2、TCP1-3、TCP1-4,以羅非魚基因組DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，進(jìn)行SSCP分析。結(jié)果分析表明：引物TCP1-1、TCP1-2、TCP1-3均無帶型多態(tài)性，引物TCP1-4在10 ℃樣本無帶型多態(tài)性。只有引物TCP1-4在8、12、14 ℃樣本電泳結(jié)果呈現(xiàn)帶型多態(tài)性，詳見圖1。

2.1.1 引物TCP1-4在不同低溫脅迫樣本擴(kuò)增的電泳結(jié)果

引物TCP1-4在8、12和14 ℃樣本的電泳結(jié)果中均有2種不同帶型(圖1)，根據(jù)每個(gè)條帶呈現(xiàn)數(shù)目的不同分別命名為基因型 AA和基因型AB，統(tǒng)計(jì)樣本的基因型頻率及等位基因頻率結(jié)果見表2。

根據(jù)每個(gè)條帶呈現(xiàn)數(shù)目的不同分別命名為基因型 AA、AB圖1 引物TCP1-4在8、12和14 ℃樣品擴(kuò)增的電泳結(jié)果Fig.1 Amplified electrophoresis diagram of TCP1-4 primer in 8 ℃,12 ℃ and 14 ℃ sample

從表2可知，在8 ℃不耐低溫組樣本中基因型AA、AB的基因型頻率分別為81.25%和18.75%，AA的基因型頻率顯著高于AB基因型頻率,在不耐低溫組中占優(yōu)勢(shì)地位。耐低溫組中基因型AA、AB的基因型頻率均為50.00%。2組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，不耐低溫組的AA基因型頻率和等位基因A的頻率均高于耐低溫組。

表2 不同低溫樣品引物TCP1-4的基因型頻率及等位基因頻率Tab.2 Genotypic frequency and allele frequency of TCP1-4 primer on low temperature sample

在12 ℃和14 ℃樣本中：不耐低溫組基因型AA、AB的基因型頻率均為81.25%和18.75%；等位基因A的頻率為90.62%，顯著高于等位基因B的頻率9.38%，占優(yōu)勢(shì)地位。耐低溫組樣品中AB的基因型頻率分別為56.25%和62.50%，等位基因A的頻率分別為75.00%和68.75%；2組中基因型AB的頻率均高于基因型AA的頻率，等位基因A的頻率均處于優(yōu)勢(shì)地位。

2.2 TCP-1-eta基因多態(tài)性與羅非魚耐寒性狀的相關(guān)性分析

羅非魚TCP1-4引物PCR擴(kuò)增片段SSCP分析的多態(tài)性與耐寒性狀的相關(guān)性結(jié)果表明：不耐低溫組和耐低溫組均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，引物TCP1-4在8 ℃(不耐低溫組和耐低溫組)樣品的位點(diǎn)，AA、AB基因型的分布與羅非魚耐寒性狀的相關(guān)性不顯著(χ2=3.463，P=0.063)。同時(shí)，不耐低溫組中AA基因型頻率81.25% 比AB基因型頻率18.75%高62.50%，處于優(yōu)勢(shì)地位；耐低溫組中AA、AB基因型頻率相同，均為50.00%。引物TCP1-4在12 ℃(不耐低溫組和耐低溫組)樣品的位點(diǎn)，AA、AB基因型的分布與耐寒性狀有顯著的相關(guān)性(χ2=4.800，P=0.028)。此時(shí)，在不耐低溫組中AA基因型頻率為81.25%，等位基因A的頻率90.62%高于等位基因B的頻率9.38%，AA基因型處于優(yōu)勢(shì)地位；在耐低溫組中 AB基因型頻率為56.25%，占優(yōu)勢(shì)地位。引物TCP1-4 在14 ℃(不耐低溫組和耐低溫組)的位點(diǎn)，基因型AA、AB的分布與耐寒性狀有顯著的相關(guān)性(χ2= 6.348，P=0.012)，等位基因A和基因型AB的頻率在耐低溫組中占優(yōu)勢(shì)地位。

3 討論

3.1 吉富羅非魚TCP-1-eta基因的PCR-SSCP多態(tài)性分析

近年來，有關(guān)魚類耐寒能力的研究已經(jīng)廣泛展開，主要集中在2大方面：一方面是探究魚類的低溫耐受分子機(jī)制；另一方面是魚類低溫耐受的相關(guān)功能基因研究[13]。目前，針對(duì)羅非魚耐寒性狀的基因與機(jī)制的報(bào)道也有不少，文獻(xiàn)[14]通過鑒定與羅非魚耐寒性狀相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)和相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)基因 PAKLIP、LOC100697261、LOC100696456 的表達(dá)對(duì)其溫度有影響。Zerai等[15]研究發(fā)現(xiàn)Delta-9-Desaturase基因?qū)δ崃_羅非魚急慢性寒冷應(yīng)激相關(guān)。但至今，關(guān)于羅非魚TCP-1-eta基因與其耐寒能力之間相關(guān)性的研究報(bào)道較少。本文對(duì)羅非魚TCP-1-eta基因的多態(tài)性與耐寒性狀之間的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)：引物TCP1-1、TCP1-2、TCP1-3、TCP1-4(10 ℃)的結(jié)果均顯示無帶型多態(tài)性。引物TCP1-4在8、12、14 ℃時(shí)均呈現(xiàn)帶型多態(tài)性，而且2組(耐低溫組和不耐低溫組)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明種群處于遺傳平衡狀態(tài)。

3.2 TCP-1-eta基因多態(tài)性與耐寒性狀的相關(guān)性分析

對(duì)不耐低溫組與耐低溫組TCP-1-eta基因PCR-SSCP分析的基因型、基因型頻率、等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TCP-1-eta基因中引物TCP1-4最終恒定溫度降為12、14 ℃的位點(diǎn)，其基因型AA、AB的分布與耐寒性狀之間的相關(guān)性顯著(P<0.05)，而在溫度降為8 ℃的位點(diǎn)，2種基因型的分布與耐寒性狀之間的相關(guān)性不顯著(P>0.05)。AA基因型頻率在不耐低溫組中處于優(yōu)勢(shì)地位，AB基因型頻率在耐低溫組中處于優(yōu)勢(shì)地位，由此可推測(cè)，AB基因型在處于低溫環(huán)境時(shí)有優(yōu)勢(shì)地位，與羅非魚的耐寒能力有關(guān)，TCP-1-eta基因可推斷為羅非魚潛在的耐寒基因。謝建麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在低溫誘導(dǎo)情況下，隨著低溫脅迫程度加強(qiáng),尼羅羅非魚TCP-1-eta基因表達(dá)上調(diào)幅度增大，說明TCP-1-eta是低溫誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá)的基因，并推測(cè)出TCP-1-eta基因是尼羅羅非魚潛在的耐寒相關(guān)基因，與本文的推測(cè)一致，說明TCP-1-eta 基因與羅非魚低溫耐受能力相關(guān)。

4 結(jié)論

羅非魚TCP-1-eta基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物TCP1-4在8、12、14 ℃時(shí)樣本電泳結(jié)果呈現(xiàn)多態(tài)性，而且12、14 ℃樣本的AA、AB基因型分布與耐寒性狀有顯著的相關(guān)性(P<0.05)。據(jù)此推測(cè)，TCP-1-eta基因是潛在的羅非魚耐寒相關(guān)基因。研究結(jié)果為分子標(biāo)記耐寒性狀和輔助羅非魚耐寒品種選育提供了理論依據(jù)。