地衣芽孢桿菌的分離和鑒定

布帕提買(mǎi)木·麥麥提 潘姣姣 阿迪萊·卡哈曼 伍麥爾·麥海提陳薈旭 張秋林 李蓮瑞

摘 要：為了從土壤中分離得到地衣芽孢桿菌，開(kāi)展后續(xù)研究，試驗(yàn)采集塔里木盆地的土壤進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，采用臺(tái)盼藍(lán)平板方法，對(duì)分離培養(yǎng)得到的單菌落進(jìn)行生物學(xué)特性研究、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA鑒定。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步鑒定為芽孢桿菌，提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送測(cè)序。結(jié)果表明，從塔里木盆地土壤中分離得到的細(xì)菌為地衣芽孢桿菌，說(shuō)明該土壤中存在地衣芽孢桿菌，并為后續(xù)進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：土壤;分離和鑒定;16S rDNA;地衣芽孢桿菌

中圖分類(lèi)號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200915005

收稿日期：2020-08-17

基金項(xiàng)目：大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201810757029）

作者簡(jiǎn)介：布帕提買(mǎi)木·麥麥提（1996-），女，碩士在讀。研究方向：動(dòng)物性食品衛(wèi)生與安全;通信作者李蓮瑞（1968-），女，博士，教授。研究方向：動(dòng)物性食品衛(wèi)生與安全。

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）為革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛分布于微生物混合培養(yǎng)物中[1]。呈桿狀，芽孢為橢圓形，孢囊稍膨大，為非致病性菌，細(xì)菌最適生長(zhǎng)溫度約為50℃，酶的最適生長(zhǎng)溫度為37℃。地衣芽胞桿菌耐熱、含酶量多、產(chǎn)酶量高的優(yōu)良特性被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，主要用來(lái)生產(chǎn)淀粉酶[2]及蛋白酶[3]。芽孢桿菌具有耐酸、耐鹽、耐高溫等特點(diǎn)，這使得其可以在條件不利的情況下形成芽孢，自我保護(hù)，并在環(huán)境適宜的條件下復(fù)活。地衣芽孢桿菌在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生多種酶和活性物質(zhì)，具有益生保健[4]，降解農(nóng)藥[5]和凈化水體[6]的作用。為了解塔里木盆地土壤中是否存在地衣芽孢桿菌，本試驗(yàn)從塔里木盆地的1份土壤中篩選出1株鏡檢有芽孢的單菌落，對(duì)該菌株進(jìn)行分離純化，經(jīng)過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定、16S rDNA基因測(cè)序，最終鑒定為地衣芽孢桿菌，且為后續(xù)開(kāi)展地衣芽孢桿菌的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1?材料

1.1?樣品采集

新疆塔里木大學(xué)校園肥沃菜地距地表20～80cm土樣。

1.2?主要試驗(yàn)儀器

恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為GHP-9080），購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;小型臺(tái)式高速離心機(jī)（型號(hào)為Eppendorf 5453），購(gòu)自北京創(chuàng)世云博科技發(fā)展有限公司;潔凈工作臺(tái)（型號(hào)為SW-CJ-2ED），購(gòu)自上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司;顯微鏡（型號(hào)為尼康 ECLIPSE Ci-L），購(gòu)自成貫儀器（上海）有限公司;搖床（型號(hào)為ZWY-2102C），購(gòu)自濟(jì)南宇晗醫(yī)療器械有限公司;加熱制冷循環(huán)器（型號(hào)為JULABO Labortechnik GmbH F12），購(gòu)自?xún)?yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司。

1.3?試驗(yàn)藥品

鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、明膠、氯化鈉、七水硫酸鎂、淀粉、硫酸銨、盧哥氏碘液、硝酸鉀、格里斯亞硝酸鹽試劑、0.04%酚紅、Ehrlish試劑、二甲苯、DL-苯丙氨酸、10%氯化鐵、磷酸二氫銨、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、0.1%酪氨酸、臺(tái)盼藍(lán)、瓊脂粉、酵母粉、酵母膏、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、濃鹽酸、可溶性淀粉，均為國(guó)產(chǎn);牛肉浸粉、牛肉膏、蛋白胨，均購(gòu)自Sigma公司。

2?方法

2.1?細(xì)菌的分離處理

2.1.1?制樣品稀釋液

取樣品土壤500g置于80℃烘箱中烘烤24h，過(guò)篩，稱(chēng)取150g土壤放入燒杯中，加水至350mL，煮沸15min，過(guò)濾，取濾液，制成1∶10濃度的懸液。另取裝有無(wú)菌水的試管6支，編號(hào)10-1、10-2、10-3、10-4，10-5、10-6進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)迫?00μL 10-1管中土壤懸液于10-2管中混勻，然后移取500 μL 10-2管中土壤懸液于10-3管中混勻，直至稀釋到10-6管，另取500μL 10-6管中液體棄去。

2.1.2?培養(yǎng)

從10-4、10-5、10-6管的稀釋液中取150μL滴加到臺(tái)盼藍(lán)選擇培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24h。

2.1.3?分離單菌落

挑取有透明圈的單菌落，接種于滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃，180rpm搖床中培養(yǎng)6h。

2.1.4?純化

采用平板涂布法，用微量移液器分別移取20μL、50μL、100μL、150μL、200μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，并重復(fù)此步驟多次達(dá)到純化。

2.2?生物學(xué)特性研究

2.2.1?菌落培養(yǎng)特征

在臺(tái)盼藍(lán)選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄。

2.2.2?菌體形態(tài)觀察

挑取培養(yǎng)的單菌落，進(jìn)行革蘭染色與孔雀石綠染色，鏡檢，觀察形態(tài)。

2.2.3?革蘭染色[7]

用接種環(huán)挑取LB平板上生長(zhǎng)的單菌落，在滴有蒸餾水的載玻片上均勻涂開(kāi)，將涂好的玻片用酒精燈火焰固定，在涂片處用結(jié)晶紫染色液處理1min，用水沖洗干凈;碘液處理1min，用水沖洗干凈;95%的乙醇脫色處理30s，用水沖洗干凈;沙黃復(fù)染15s，用水沖凈，烘干，油鏡下觀察。

2.2.4?孔雀石綠染色[8]

切片用飽和的孔雀石綠水溶液染10min，蒸餾水沖洗;0.5%番紅復(fù)染30s;水洗，吸干;鏡檢，芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。

2.2.5?血平板試驗(yàn)

采用新疆多浪綿羊血制作血平板，將菌株接種于血平板上，觀察溶血現(xiàn)象。

2.3?細(xì)菌的生化鑒定

地衣芽孢桿菌鑒定參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10]的方法，對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

2.3.1?檸檬酸鹽利用試驗(yàn)

無(wú)菌條件下，將單菌落接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)3～7d，觀察顏色變化。

2.3.2?丙酸鹽利用試驗(yàn)

將菌種劃線(xiàn)接種于丙酸鹽培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)，連續(xù)3代移種，觀察顏色變化。

2.3.3?淀粉水解試驗(yàn)

用接種環(huán)取菌種涂布在培養(yǎng)基表面，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，取出后滴加碘液，觀察菌落周?chē)兓?/p>

2.3.4?卵黃卵磷脂酶試驗(yàn)

接種環(huán)取少量幼齡菌種（培養(yǎng)18～24h）涂布于卵黃卵磷脂酶平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察菌落四周是否出現(xiàn)不透明區(qū)。

2.3.5?硝酸鹽還原試驗(yàn)

取純培養(yǎng)物接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h，加入試劑3～5滴，30s內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。

2.3.6?吲哚試驗(yàn)

將菌種接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，取出加入2mL二甲苯，搖勻靜置，沿試管壁緩慢加入Ehrlish試劑2mL，靜置，觀察顏色變化。

2.4?地衣芽孢桿菌16S rDNA的鑒定

2.4.1?基因組DNA的提取

細(xì)菌DNA提取方法按照北京全式金生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒（M10208）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.4.2?16S rDNA基因擴(kuò)增

選擇通用引物擴(kuò)增芽孢桿菌16S rDNA的全長(zhǎng)序列。細(xì)菌通用引物序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：DNA模板1μL;上游引物和下游引物各1μL;EasyTaq Super Mix 25μL，加入ddH2O補(bǔ)至50μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，55℃退火30s;72℃延伸90s;35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。

2.4.3?純化和測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD19-T載體連接，送由北京天一輝遠(yuǎn)有限公司測(cè)序，將測(cè)定的序列通過(guò)NCBI/BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì)，確定其具體的菌屬。

3?結(jié)果與分析

3.1?細(xì)菌的培養(yǎng)

對(duì)菌液用無(wú)菌水分別進(jìn)行6個(gè)梯度稀釋?zhuān)糜谂_(tái)盼藍(lán)篩選平板上。結(jié)果表明，隨著稀釋倍數(shù)的增大平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)減少，逐漸出現(xiàn)單菌落。

3.2?細(xì)菌形態(tài)

挑取白色透明圈的單菌落，進(jìn)行革蘭染色，鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖1，待檢菌革蘭染色呈陽(yáng)性，菌體呈直桿狀，兩端鈍圓?？兹甘G染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.3?菌落形態(tài)及血平板毒力測(cè)試

將該菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，觀察菌落呈圓形、扁平、表面粗糙，邊緣不整齊，灰白不透明，培養(yǎng)24h后菌落趨于相互融合，菌苔表面出現(xiàn)山丘狀和裂葉狀（見(jiàn)圖3）;將該菌劃線(xiàn)接種于血平板上，培養(yǎng)24h后，未出現(xiàn)溶血環(huán)，觀察落菌形態(tài)邊緣光滑，不規(guī)則，表面濕潤(rùn)，無(wú)透明或不透明的灰白色小菌落（見(jiàn)圖4）。

3.4?生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果

3.4.1?丙酸鹽利用、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在丙酸鹽利用試驗(yàn)中，將菌種劃線(xiàn)接種于丙酸鹽培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基變藍(lán)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性;在檸檬酸鹽的利用試驗(yàn)中，適溫培養(yǎng)4d后，培養(yǎng)基對(duì)光旋轉(zhuǎn)呈藍(lán)色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

3.4.2?淀粉、卵黃卵磷脂、硝酸鹽還原試驗(yàn)結(jié)果

將該菌接種于淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，滴加碘液，菌落周?chē)霈F(xiàn)不變色透明圈，淀粉水解呈陽(yáng)性;將該菌接種到卵黃卵磷脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，觀察菌落四周有渾濁環(huán)出現(xiàn)，表示卵磷脂分解成脂肪，說(shuō)明分離純化的菌株中含有卵磷脂酶;將該菌接種到硝酸鹽還原為亞硝酸鹽培養(yǎng)基24h后，滴加試劑，30s內(nèi)出現(xiàn)紅色，表明該菌能將硝酸鹽還原;將該菌接種到吲哚培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)24h后，取出加入二甲苯和Ehrlish試劑，培養(yǎng)基不變色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

3.4.3?生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

淀粉水解試驗(yàn)、丙酸鹽利用試驗(yàn)、卵黃卵磷脂酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)等生物化學(xué)試驗(yàn)鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

3.5?16S rDNA的鑒定結(jié)果

3.5.1 16S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果

由圖5可以看出，成功擴(kuò)增了該菌的16S rDNA的基因序列。

3.5.2?16S rDNA克隆鑒定結(jié)果

該細(xì)菌16S rDNA的基因序列與pMD19-T連接后轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒送測(cè)序，陽(yáng)性克隆鑒定如圖6。

3.5.3?16S rDNA的序列進(jìn)化樹(shù)同源性分析結(jié)果

將測(cè)序所得序列去掉相關(guān)的載體序列后，得到該菌的全長(zhǎng)16S rDNA序列信息。該菌株的16S rDNA長(zhǎng)度為1500bp，將其結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核酸比對(duì)后，建立進(jìn)化樹(shù)。分析表明，該菌株與登錄號(hào)為KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢桿菌處于同一分支，且根據(jù)同源性分析，該菌株與登錄號(hào)為KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢桿菌同源性為100%，進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果見(jiàn)圖7，同源性比較見(jiàn)表2。根據(jù)上述結(jié)果，可以確定該菌株為地衣芽孢桿菌。

4?結(jié)論與討論

面對(duì)土壤中龐大的微生物群體，通過(guò)對(duì)一份土壤進(jìn)行高溫烘烤處理，培養(yǎng)獲得單菌落，取該菌落在臺(tái)盼藍(lán)平板上培養(yǎng)，反復(fù)純化，最終挑選長(zhǎng)出白色透明圈的菌落作為實(shí)驗(yàn)出發(fā)用菌，進(jìn)行革蘭染色和孔雀石綠染色鏡檢后，觀察細(xì)菌形態(tài)呈桿狀，兩端鈍圓，芽孢中生，孢囊稍膨大，確定分離得到1株芽孢桿菌。通過(guò)參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，又結(jié)合地衣芽孢桿菌所特有的能夠利用丙酸鹽的特性，初步鑒定為地衣芽孢桿菌。

同時(shí)，對(duì)該菌進(jìn)行檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)等一系列的生化鑒定試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌具備地衣芽孢桿菌的不可形成吲哚、不可水解酪氨酸、不具有苯丙氨酸脫氫酶的生化特征，由此可以初步斷定該菌為地衣芽孢桿菌。最終通過(guò)對(duì)該菌進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增、純化及測(cè)序，將其16S rDNA基因序列信息進(jìn)行建立進(jìn)化樹(shù)及同源性分析，進(jìn)一步確定該菌為地衣芽孢桿菌。

地衣芽孢桿菌在較高溫度下仍能生長(zhǎng)繁殖，并且能夠產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶，對(duì)有些有害菌如葡萄球菌、白色念珠菌具有明顯的抑制作用。然而，近年來(lái)對(duì)地衣芽孢桿菌的研究進(jìn)展仍報(bào)道得比較少，雖已證實(shí)其擁有良好的使用效果，但具體作用機(jī)理機(jī)制尚不明確，且其研究主要集中在抗菌特性方面，未來(lái)可利用基因工程將該菌的優(yōu)良特性與其它菌結(jié)合，構(gòu)建和表達(dá)出一種更優(yōu)良的基因，并將其應(yīng)用到更加廣泛的領(lǐng)域中。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步豐富了我國(guó)地衣芽孢桿菌的研究進(jìn)展，為地衣芽孢桿菌的進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 覃建忠，鄧正春，周詩(shī)彪，等.大豆施用含地衣芽孢桿菌生物活化酶磷肥試驗(yàn)[J].作物研究，2017，31（07）：722-723.

[2]莫靜燕，陳獻(xiàn)忠，王正祥.地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備、再生及轉(zhuǎn)化研究[J].生物技術(shù)，2009（05）：75-77.

[3]王利杰，余曉斌，方銀兵，等.可抑制致病菌的益生菌篩選及抑菌物質(zhì)的初步確定[J].生物技術(shù)通報(bào)，2017，33（11）：123-129.

[4]?Kim Y，Cho J Y，Ku K J H，et al. Identification and antimicrobial activity of phenylacetic acid produced by Bacillus Licheniformis isolated from fermented Soybean， Chnngkook-Jang[J]. Current Microbiology， 2004， 48 （4）： 312-317.

[5]?Mandal M D，Mandal S，Pal N K.Plasmid-mediated dimethoate degradation by Bacillus Licheniformis isolated from a fresh water fish Labeo rohita[J]. BioMed Research International， 2005， 25 （3）： 280-286.

[6]李木明.降解有機(jī)質(zhì)芽孢桿菌的篩選及其凈化模擬污染水體的特性[D].泉州：華僑大學(xué)，2016.

[7]?黃荔豐.微課“革蘭染色”的教學(xué)設(shè)計(jì)[J].課程教育研究，2017（41）：19.

[8]?樊佳，韓煦，陶榆瑋，等.芽孢染色實(shí)驗(yàn)中枯草桿菌最佳培養(yǎng)條件探索[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2018，35（03）：58-61.

[9]?東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京：北京科學(xué)教育出版社，2001.

[10]?伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].第九版.科學(xué)出版社，1994.

（責(zé)任編輯?周康）