甘二酯對(duì)油脂中抗氧化劑活性的影響

薛元強(qiáng)，劉思敏，韓立娟,2，齊玉堂,2，賀軍波,2，張維農(nóng),2

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023; 2.湖北省油脂精細(xì)化工工程技術(shù)研究中心，武漢 430023)

油脂中的不飽和脂肪酸在光、熱、酶等條件作用下易與氧氣發(fā)生自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致脂肪酸分解，生成一級(jí)氧化產(chǎn)物氫過(guò)氧化物，氫過(guò)氧化物極不穩(wěn)定，很容易再次裂解產(chǎn)生二級(jí)氧化產(chǎn)物如醛、烴、酮和環(huán)氧化物[1]。油脂氧化產(chǎn)物對(duì)于油脂或含油脂食品的氣味及安全性具有不利影響[2-3]，甚至還具有致癌作用[4]。因此，抑制油脂的氧化對(duì)于食用油或含油脂食品的安全性具有重要的意義。

研究表明，溫度、光照、酶、抗氧化劑和促氧化劑等因素能夠影響油脂的氧化[5]。然而最近的研究表明，油脂中微量成分同樣能夠顯著影響油脂的氧化[6-9]。甘二酯(DAG)是油脂中主要的微量成分，主要來(lái)源于甘三酯或磷脂在植物體內(nèi)的不完全合成以及油脂在加工、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生的水解，含量通常在0.8%～5.8%[6,10]。DAG對(duì)油脂的促氧化作用[11]、抗氧化作用[12]均有報(bào)道，亦有研究表明DAG對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性并無(wú)明顯影響[13]。造成DAG對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性影響的不確定性可能與以下幾點(diǎn)因素有關(guān)：①在以往的研究中多以二油酸甘油酯為實(shí)驗(yàn)原料，但是不飽和DAG中同時(shí)具有羥基和不飽和鍵，由于兩者的聯(lián)合作用導(dǎo)致了結(jié)果的不確定性；②DAG可能與抗氧化劑存在著聯(lián)合作用，由于不同油脂中的抗氧化劑種類和含量存在差異，導(dǎo)致結(jié)果不確定。

考慮到不飽和DAG可能帶來(lái)的影響，以及DAG影響油脂氧化穩(wěn)定性的原因是其在油脂中形成了反相膠束[7]，本文選擇sn-1,3-棕櫚酸甘二酯為原料，測(cè)定DAG在油脂體系中形成反相膠束的臨界濃度，并在反相膠束體系中研究其對(duì)菜籽油氧化穩(wěn)定性及對(duì)γ-生育酚、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、丁基羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)4種抗氧化劑活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菜籽油，當(dāng)?shù)爻?；sn-1,3-棕櫚酸甘二酯(純度99%)，實(shí)驗(yàn)室自制；硅膠(300～400目)、活性炭(>200目)、7,7,8,8-四腈基-對(duì)苯醌二甲烷(TCNQ，純度95%)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ，純度98%)、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT，純度99%)、丁基羥基茴香醚(BHA,純度98%)，阿拉丁試劑有限公司；正己烷、氯仿、冰乙酸、碘化鉀，均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；γ-生育酚(純度97%)，百靈威試劑有限公司。

分析天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；循環(huán)水真空泵；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)；Lambda25型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，PerkinElmer有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菜籽油的純化

根據(jù)Boon等[14]的方法稍作改進(jìn)。稱取88 g硅膠和12 g活性炭，在110℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥20 h。取尺寸為30 cm×4 cm的層析柱，通過(guò)干法裝柱的方式依次填充44 g硅膠、12 g活性炭以及剩余的44 g硅膠。取100 g菜籽油溶解在100 mL正己烷中，裝入層析柱，然后用400 mL正己烷洗脫，收集所有洗脫液，并通過(guò)旋蒸(38℃)去除洗脫液中的溶劑，最后通過(guò)氮吹去除殘留的痕量溶劑，即得純凈菜籽油，儲(chǔ)存在-20℃的冰箱中，待測(cè)。

1.2.2 菜籽油理化指標(biāo)及微量成分測(cè)定

酸價(jià)的測(cè)定參照GB 5009.229—2016，過(guò)氧化值的測(cè)定參照GB 5009.227—2016，生育酚及甾醇含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]。

1.2.3 菜籽油脂肪酸組成的測(cè)定

取0.1 g左右樣品于甲酯化管，加入2 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，渦旋混勻，在65℃水浴下反應(yīng)30 min后加入2 mL三氟化硼-甲醇，65℃水浴3 min，冷卻后加入2 mL正己烷，振蕩，靜置分層，取上層清液，供GC分析。

GC條件：Sopelco sp-2560石英毛細(xì)管色譜柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；載氣為高純氮?dú)?，恒壓模式，壓?15.87 kPa；分流比20∶1，進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器溫度250℃；柱溫100℃保持4 min，以3℃/min升至230℃，保持20 min(總分析時(shí)間67.33 min)。

1.2.4 菜籽油單甘酯、DAG含量的測(cè)定

單甘酯及DAG含量參照AOCS Cd 11d-96方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 DAG臨界膠束濃度的測(cè)定

DAG臨界膠束濃度根據(jù)Chen等[7]的方法測(cè)定。將0.1%、0.2%、0.5%、1%的DAG溶解在純凈菜籽油中，并在40℃下攪拌12 h。分別取上述樣品5 g于10 mL樣品瓶中，加入5 mg TCNQ，混合攪拌5 h，過(guò)量的TCNQ通過(guò)6 500 r/min離心20 min除去。通過(guò)分光光度法測(cè)定所有樣品在480 nm的吸光度，繪制DAG含量對(duì)數(shù)與吸光度的曲線。DAG臨界膠束濃度為低DAG含量的點(diǎn)組成的直線與高DAG含量的點(diǎn)組成的直線的交點(diǎn)。

1.2.6 加速氧化實(shí)驗(yàn)

取純凈菜籽油20 g，分別加入1%DAG、1%DAG+0.02%γ-生育酚、0.02%γ-生育酚、1% DAG+0.02%TBHQ、0.02%TBHQ、1% DAG+0.02%BHT、0.02%BHT、1% DAG+0.02%BHA、0.02%BHA，并以無(wú)添加的純凈菜籽油作為對(duì)比樣。所有樣品在60℃鼓風(fēng)干燥箱中加速氧化，并在1、2、3、4、5、6、7 d取樣測(cè)定過(guò)氧化值。所有樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化前后菜籽油的指標(biāo)變化

菜籽油中除了甘油三酯成分，還含有少量的單甘酯、DAG、甾醇、生育酚、色素等物質(zhì)，為了避免這些少量成分對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，本文通過(guò)硅膠和活性炭吸附去除油脂中的上述物質(zhì)，得到純凈的菜籽油。對(duì)純化前后菜籽油的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菜籽油純化前后相關(guān)指標(biāo)變化

由表1可知，經(jīng)過(guò)柱層析純化后的菜籽油與未經(jīng)純化的菜籽油脂肪酸組成無(wú)明顯變化，同時(shí)色素、生育酚、甾醇、單甘酯、DAG、游離脂肪酸及過(guò)氧化物除去得較為徹底，因此通過(guò)柱層析的方法得到的純凈菜籽油適合用于加速氧化研究。

2.2 DAG臨界膠束濃度

具有表面活性的物質(zhì)溶解在弱極性的體系(如甘油三酯)中，隨著表面活性劑濃度增大到一定的值時(shí)，體系的理化性質(zhì)(如表面張力、溶解度、滲透壓、導(dǎo)電度、可溶性、增容等)會(huì)發(fā)生跳躍性變化，此時(shí)的濃度稱為臨界膠束濃度，并且在等于或大于該濃度時(shí)，會(huì)形成反相膠束。TCNQ脂溶性差，且分散在非極性溶劑時(shí)在480 nm處沒(méi)有吸收。當(dāng)表面活性劑濃度高于臨界膠束濃度時(shí)，TCNQ可與表面活性劑發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移相互作用，并可吸收480 nm波長(zhǎng)的光，通過(guò)檢測(cè)不同DAG濃度下菜籽油在480 nm處吸光度的變化，即可測(cè)定DAG臨界膠束濃度。按照1.2.5方法測(cè)得DAG臨界膠束濃度為0.5%。

2.3 加速氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

純凈菜籽油及添加1%DAG后過(guò)氧化值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化如圖1所示。由圖1可看出，添加1%DAG的菜籽油在6 d前過(guò)氧化值均大于純凈菜籽油，且其在2 d時(shí)進(jìn)入指數(shù)氧化階段，純凈菜籽油在3 d時(shí)進(jìn)入指數(shù)氧化階段，因此添加1%DAG促進(jìn)了純凈菜籽油的氧化。研究表明，反相膠束形成的微環(huán)境能夠加快反應(yīng)的速度[16]，本研究中DAG加快菜籽油氧化速率可能是因?yàn)榉聪嗄z束的存在為氧化反應(yīng)提供了場(chǎng)所，同時(shí)加快了氧化反應(yīng)。

圖1 純凈菜籽油及添加1%DAG后過(guò)氧化值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化

圖2為純凈菜籽油添加γ-生育酚及1% DAG與γ-生育酚后過(guò)氧化值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化。由圖2可看出：0～1 d時(shí)，同時(shí)添加1%DAG與γ-生育酚比僅添加γ-生育酚的菜籽油過(guò)氧化值上升速率快；1 d之后，僅添加γ-生育酚的菜籽油過(guò)氧化值快速上升，而添加1%DAG與γ-生育酚的菜籽油過(guò)氧化值上升速率緩慢；在3 d時(shí)，僅添加γ-生育酚的菜籽油過(guò)氧化值為14.53 mmol/kg，而同時(shí)添加γ-生育酚和1%DAG的菜籽油過(guò)氧化值僅為6.47 mmol/kg，原因可能是DAG的添加增加了γ-生育酚的活性。Chen等[13]研究二油酸DAG對(duì)生育酚的抗氧化活性影響，結(jié)果表明，添加0.5%～2.5%的DAG并未影響大豆油中生育酚的活性，同時(shí)也未觀測(cè)到反相膠束的形成。但以DOPC為原料制備出反相膠束后，大豆油中生育酚的活性得到了增強(qiáng)[8]，與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致。綜上所述，反相膠束的存在對(duì)于抗氧化劑的活性有著重要的影響，許多觀點(diǎn)認(rèn)為，反相膠束能夠增加抗氧化劑的溶解度，并使得抗氧化劑向反相膠束形成的部位聚集，最終因?yàn)闈舛鹊脑黾佣龃笃淝宄杂苫哪芰?。結(jié)合圖1結(jié)果，推測(cè)在本實(shí)驗(yàn)中，DAG對(duì)γ-生育酚的影響機(jī)理為：在0～1 d，生育酚還沒(méi)有完全遷移到反相膠束部位，DAG仍然是主要作用因素，此時(shí)氧化速率更快;在1 d后，γ-生育酚已經(jīng)充分遷移到反相膠束部位，能夠與氫過(guò)氧化物充分接觸，從而發(fā)揮其抗氧化作用。

圖2 純凈菜籽油添加γ-生育酚及1%DAG與γ-生育酚后過(guò)氧化值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化

圖3為純凈菜籽油添加TBHQ及1%DAG與TBHQ后過(guò)氧化值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化。由圖3可看出，在儲(chǔ)藏過(guò)程中，添加1%DAG及TBHQ的菜籽油過(guò)氧化值始終大于僅添加TBHQ的菜籽油。在儲(chǔ)藏過(guò)程中，僅添加TBHQ的菜籽油過(guò)氧化值無(wú)明顯上升，但是添加1%DAG與TBHQ的菜籽油在6 d后就已超出GB 2716—2018規(guī)定的限量(9.85 mmol/kg)，因此DAG的加入抑制了TBHQ的抗氧化活性。

圖3 純凈菜籽油添加TBHQ及1%DAG與TBHQ后過(guò)氧化值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化

圖4為純凈菜籽油添加BHA及1%DAG與BHA后過(guò)氧化值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化。由圖4可看出，與TBHQ的變化類似，添加1%DAG與BHA的菜籽油氧化穩(wěn)定性明顯弱于僅添加BHA的菜籽油，因此DAG抑制了BHA的抗氧化活性。通過(guò)比較DAG對(duì)TBHQ、BHA抗氧化活性的抑制率，發(fā)現(xiàn)1～7 d，DAG對(duì)TBHQ的平均抑制率(0.82)高于對(duì)BHA的平均抑制率(0.71)，說(shuō)明與TBHQ相比，DAG對(duì)BHA的抑制強(qiáng)度更弱。

圖4 純凈菜籽油添加BHA及1%DAG與BHA后過(guò)氧化值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化

圖5為純凈菜籽油添加BHT及1%DAG與BHT后過(guò)氧化值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化。由圖5可看出：2 d前，添加1%DAG與BHT的菜籽油過(guò)氧化值上升速率高于僅添加BHT的菜籽油，2 d后，添加1%DAG與BHT的菜籽油比僅添加BHT過(guò)氧化值上升速率慢；在4 d時(shí)，僅添加BHT的菜籽油過(guò)氧化值為10.91 mmol/kg，已經(jīng)超過(guò)出GB 2716—2018規(guī)定的限量(9.85 mmol/kg)，而此時(shí)添加1%DAG與BHT的菜籽油過(guò)氧化值為8.33 mmol/kg。因此，DAG增強(qiáng)了BHT的抗氧化活性，這與DAG對(duì)γ-生育酚的變化趨勢(shì)類似。

圖5 純凈菜籽油添加BHT及1%DAG與BHT后過(guò)氧化值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化

圖1～圖5結(jié)果表明，DAG對(duì)于不同抗氧化劑的影響趨勢(shì)存在差異，在本研究中，DAG能夠增加氧化速率，增強(qiáng)抗氧化劑γ-生育酚和BHT的活性，而對(duì)TBHQ和BHA的活性有抑制作用。TBHQ的抗氧化效果優(yōu)于BHT和BHA，但DAG對(duì)TBHQ的抑制作用更明顯，這可能與抗氧化劑在臨界膠束部位的分布有關(guān)。DAG達(dá)到臨界膠束濃度后可能會(huì)形成以水核為中心，四周包裹DAG的球形反相膠束，許多觀點(diǎn)認(rèn)為，反相膠束可能是油脂氧化的場(chǎng)所，在該假設(shè)的基礎(chǔ)上，油脂氧化產(chǎn)物形成后，極性較弱的氫過(guò)氧化物會(huì)向反相膠束的外表面遷移，同時(shí)抗氧化劑會(huì)朝著DAG形成的部位遷移并聚集，由于不同極性的抗氧化劑在反相膠束的分布可能不一樣，極性較強(qiáng)的抗氧化劑更有可能進(jìn)入水核而難以與氫過(guò)氧化物接觸，而極性較弱的抗氧化劑可能更容易聚集在反相膠束的表面和氫過(guò)氧化物接觸，從而充分發(fā)揮抗氧化活性。4種抗氧化劑的分子極性強(qiáng)弱關(guān)系為γ-生育酚

3 結(jié) 論

對(duì)sn-1,3-棕櫚酸甘二酯對(duì)純凈菜籽油氧化穩(wěn)定性的影響進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菜籽油中的sn-1,3-棕櫚酸甘油二酯臨界膠束濃度為0.5%，在反相膠束體系中DAG具有促氧化作用，且在該體系中DAG與γ-生育酚及其他抗氧化劑聯(lián)合作用，表現(xiàn)出了不同的效果：DAG增強(qiáng)了γ-生育酚及BHT的抗氧化活性，但是抑制了TBHQ和BHA的活性。本文初步闡明了DAG對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性的影響情況，并且對(duì)于DAG多種不同的影響趨勢(shì)也有了一個(gè)合理的解釋：①DAG對(duì)于油脂氧化穩(wěn)定性的影響取決于其在油脂中的物理結(jié)構(gòu)，反相膠束可能是影響油脂氧化穩(wěn)定性的根本原因；②DAG形成反相膠束后，油脂的氧化穩(wěn)定性還取決于其加快氧化速率及增大抗氧化劑活性兩種反應(yīng)的平衡，同時(shí)也取決于抗氧化劑在反相膠束部位的分布。本研究對(duì)于油脂氧化研究以及尋找安全的抗氧化方法提供了新的思路。