朱 紅，王夢飛，焦宏亮，王金鵬，周 華，蔡 恒

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

自由基的生成在老齡化相關(guān)的疾病中起著核心作用[1-3]。自由基作為生物體的基本保護機制，能夠參與各種代謝信號途徑的調(diào)節(jié)，傳遞生命活動所需的能量，也可作為吞噬細(xì)胞消滅細(xì)菌或病原體的主要介質(zhì)。此外，自由基還影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達，參與重要生命活動的調(diào)節(jié)[4]，但自由基尤其是活性氧(ROS)的過量生成則會造成機體內(nèi)氧化/還原的失衡，促進氧化應(yīng)激(oxidative stress)的發(fā)生，致使細(xì)胞結(jié)構(gòu)、脂類、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)等遭到破壞，進而引起細(xì)胞凋亡，誘發(fā)疾病。

ROS主要有2種來源:一種是內(nèi)源性來源，如線粒體、NADPH氧化酶和過氧化酶體等，其中有超過80%活性氧是由于線粒體呼吸鏈氧化磷酸化過程中電子泄漏引起的[5-6]；另一種外源性來源，如外源輻射、病原體或重金屬的刺激等[7]。由ROS引起的冠心病、糖尿病和腫瘤等疾病的病理機制研究已取得較大進展[8-13]。大腦對ROS尤為敏感[14]，過多的ROS刺激更易誘發(fā)帕金森病和阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變發(fā)生[15-17]。因此，針對ROS生成或ROS損傷預(yù)防的研究具有重要意義。酵母體內(nèi)衰老代謝機制與人體細(xì)胞衰老機制相似，并且酵母基因組與人類基因組高度同源，其生長代謝規(guī)律簡單獨特，單倍體狀態(tài)的可操作性更有利于進行多操作實驗，因而成為細(xì)胞抗衰老和疾病研究的最優(yōu)模型[18]。

酵母作為一種需氧生物，常常受到高水平活性氧的毒害，已進化出一套較為完整的抗氧防御系統(tǒng)，主要包括非酶系防御系統(tǒng)和酶系防御系統(tǒng)兩大類。酶系防御系統(tǒng)主要由過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等組成，非酶系防御系統(tǒng)則主要由谷胱甘肽、硫氧還蛋白等組成，其中谷胱甘肽最為重要。真核生物細(xì)胞壁完整性信號通路(CWI)能檢測真菌細(xì)胞在受到高滲、熱刺激、抗真菌藥物等環(huán)境刺激時產(chǎn)生的胞壁脅迫信號并及時作出應(yīng)答。Goossens等[19]研究發(fā)現(xiàn)NST1基因的敲除增強了酵母的耐鹽能力，但其具體機制未知。Leng等[20]研究發(fā)現(xiàn)NST1基因編碼的蛋白作為一種高滲透壓甘油響應(yīng)途徑(HOG)的“補充途徑”加強了CWI途徑，從而提高酵母細(xì)胞的耐熱能力。這對研究CWI途徑在抗氧化影響方面提供了思路。

因此，本研究中，筆者采用Cre-LoxP系統(tǒng)、Kanr抗性標(biāo)記和同源重組技術(shù)敲除NST1基因，構(gòu)建釀酒酵母NST1基因缺失菌株，以分析NST1基因?qū)湍缚寡趸芰Φ挠绊憽?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、試劑及引物

釀酒酵母BY4741(S.cerevisiaeBY4741，MATahis3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)、質(zhì)粒pUC18保藏于筆者所在實驗室；質(zhì)粒pUG6在大腸桿菌中具有氨芐青霉素抗性，質(zhì)粒pUG6帶有Kanr抗性基因，且兩端帶有l(wèi)oxp位點，廣西大學(xué)杜麗琴教授惠贈；質(zhì)粒pYES2由天津科技大學(xué)惠贈，在大腸桿菌中具有氨芐青霉素抗性，能利用半乳糖誘導(dǎo)蛋白在酵母中表達。

rTaq酶、HindⅢ、SacⅠ、T4連接酶、PrimeSTAR@Max DNA Polymerase、DNA Marker DL2000、dNTP Mixture、Agarose Gel DNA Purification、5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)、質(zhì)粒小量提取試劑盒、小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及相關(guān)限制酶，TaKaRa 公司；基因提取試劑盒、G418，生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR 儀，Biometra公司；電轉(zhuǎn)儀、凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad 公司；高速冷凍離心機，Eppendorf公司；熒光顯微鏡，德國萊卡公司；超低溫冰箱，Sanyo公司；培養(yǎng)箱，上海志成生物公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

根據(jù)酶母基因組數(shù)據(jù)庫(SGD)數(shù)據(jù)庫的NST1基因(S000005035)和 GenBank 的質(zhì)粒序列設(shè)計引物，敲除引物，命名為QC-F、QC-R，基因NST1驗證引物為 A、Yz-a、Yz-b和B。根據(jù)HindⅢ、SacⅠ酶切位點設(shè)計NST1回補引物HB-F、HB-R。引物均由南京金斯瑞有限公司合成，所涉及的引物及其序列見表1。

表1 構(gòu)建菌株引物

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L；自然pH，去離子水定容至1 000 mL，滅菌待用，微量氨芐青霉素(Amp)。

YPD+G418培養(yǎng)基：每50 mL培養(yǎng)基加入500 μL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的G418母液，終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，用于酵母轉(zhuǎn)化子的篩選。

半乳糖誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5、蛋白胨10、半乳糖20。

SC-Ura培養(yǎng)基：每100 mL培養(yǎng)基中含20 g/L葡萄糖，6.7 g/L Yeast Nitrogen Base(YNB)，L-Leu、L-His和L-Met(質(zhì)量濃度為10 mg/mL)各1 mL，固體培養(yǎng)基需加入15～20 g/L瓊脂。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5、胰蛋白胨 10、NaCl 10、瓊脂 20(配制固體培養(yǎng)基)。用于大腸桿菌的培養(yǎng)和保藏。

LB+Amp培養(yǎng)基：每100 mL培養(yǎng)基加入100 μL的50 mg/mL的Amp母液，終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，用于含質(zhì)粒大腸桿菌的培養(yǎng)與提取。

LB藍白篩培養(yǎng)基：每100 mL培養(yǎng)基加入質(zhì)量濃度為 24 mg/mL IPTG、100 mg/mL Amp母液各100 μL,20 mg/mL X-gal 母液200 μL。

磷酸緩沖液(PBS)(g/L)：KCl 0.2、KH2PO40.24、NaCl 8.0、Na2HPO41.44；調(diào)節(jié)pH至7.4。

以上培養(yǎng)基均需在高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，葡萄糖單獨滅菌；G418與Amp須在培養(yǎng)基降至合適溫度后加入。

1.2 方法

1.2.1 含G418抗性基因(kanr)及NST1同源臂PCR擴增

所用的大腸感受態(tài)細(xì)胞及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化參照分子克隆中電擊轉(zhuǎn)化法操作。利用堿裂解法從大腸桿菌中提取質(zhì)粒pUG6，以其為模板，以 QC-F、QC-R 為引物進行 PCR擴增，獲得同源臂NST1基因敲除組件。擴增條件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；72 ℃ 2 min；72 ℃ 10 min。取 2 μL PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。該 PCR產(chǎn)物即為含G418抗性基因(kanr)及NST1同源臂目的片段，片段大小在1 800 bp左右。

1.2.2 釀酒酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備

將S.cerevisiae單菌落接種到50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按體積分?jǐn)?shù)2%接種量將種子液接種至100 mL YPD培養(yǎng)基中，接種2瓶。再于30 ℃、250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3～5 h。將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的離心管上，放置冰上30 min，并將離心機預(yù)冷至4 ℃，3 000 r/min離心15 min，去上清；用200 mL冰預(yù)冷的超純水洗滌重懸菌體，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，洗滌2次；用100 mL冰預(yù)冷的1 mol/L山梨醇洗滌重懸菌體，3 000 r/min離心15 min，去上清，再用100 mL冰預(yù)冷的山梨醇洗滌重懸菌體，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，倒去上清，用殘留的山梨醇將菌體溶解，不需加入新的山梨醇溶解。溶解后的菌體，每管50 μL分裝至冰預(yù)冷的1.5 mL EP離心管中，置于-80 ℃保存。

1.2.3NST1基因敲除菌構(gòu)建

將含G418抗性(Kanr)及NST1同源臂 PCR產(chǎn)物(約 400 ng)加入新制備的100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，轉(zhuǎn)移至2 mm電轉(zhuǎn)杯預(yù)冷5 min，并使用Eppendorf電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)化(電擊參數(shù)：電壓1.5 kV，電容25 μF，電阻400 Ω，電擊間距2 mm)。電轉(zhuǎn)后立即加入1 mL預(yù)冷山梨醇復(fù)蘇，混勻，8 000 r/min離心1 min，倒去部分上清，留下100 μL濃縮涂布于含200 μg/mL G418 的 YPD篩選平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d觀察是否有轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定

將平板上出現(xiàn)的單菌落挑選至含200 μg/mL G418 的YPD 液體培養(yǎng)液中，30 ℃培養(yǎng)過夜后，8 000 r/min離心2 min收集菌體，使用上海生工生物工程有限公司提供的試劑盒提取重組菌DNA，并以獲得的基因組為模板，用 Taq DNA 聚合酶，引物對A/Yz-a、B/Yz-b 進行PCR驗證NST1基因敲除菌，驗證成功敲除菌命名為nst1Δ。酵母基因提取參照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 回補菌株nst1Δ-NST1的構(gòu)建

以BY4741 基因組為模板，HB-F、HB-R為引物PCR擴增出帶酶切位點NST1片段。提取質(zhì)粒 pUC18和pYES2，核酸內(nèi)切酶HindⅢ和SacⅠ分別處理質(zhì)粒和PCR擴增的NST1基因，T4 DNA連接酶連接pUC18載體和基因片段，構(gòu)建載體 pUC18-nst1，電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入大腸感受態(tài)細(xì)胞。送檢測序后，HindⅢ、SacⅠ雙酶切，切膠回收。T4 DNA連接酶連接回收片段與pYES2載體，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入敲除菌nst1Δ酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于尿嘧啶營養(yǎng)缺陷平板，3 d后挑取轉(zhuǎn)化子，利用pYES2通用引物驗證。

1.2.6 不同H2O2濃度的稀釋點滴實驗

將驗證成功的重組菌接種至含100 μg/mL G418的10 mL YPD中，180 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)過夜制備種子液，離心后將細(xì)胞重懸至相似的OD600,然后分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，取3 μL分別點滴在普通YPD及含有4 mmol/L H2O2濃度平板上(半乳糖誘導(dǎo))，倒扣培養(yǎng)3 d，觀察生長情況。

1.2.7NST1基因敲除菌株生長速率比值分析

1.2.8 ROS測定

活性氧檢測試劑盒(南京建成公司)測定酵母胞內(nèi)ROS水平。將BY4741 和nst1Δ單菌落分別接種于普通YPD培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃搖床過夜培養(yǎng)，隔夜培養(yǎng)物稀釋于新鮮YPD中，調(diào)整OD600為0.1，再180 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)4 h后，分別加入4 mmol/L H2O2進行氧化處理2 h，離心后將PBS洗滌2次，PBS重懸，加入適量2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFHDA)染劑，30 ℃孵育40 min，PBS洗滌重懸，取200 μL于熒光顯微鏡中觀察。

1.2.9 熒光定量PCR測定

酵母細(xì)胞總RNA的提取按照TaKaRa試劑盒說明在4 ℃條件下提取。Q-PCR反應(yīng)液的配制(總體積20 μL)：5×PrimeScript RT Master Mix，4 μL；模板RNA，1 μL；去DEPC水，15 μL。反應(yīng)液配制均在冰上進行。輕輕混勻后，在PCR儀上按下列條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃10 min。

熒光定量PCR反應(yīng)體系。2×qPCR Master Mix，10 μL；正向引物，0.4 μL；反向引物，0.4 μL；RT反應(yīng)液(cDNA)，2 μL；dd H2O，7.2 μL。

熒光定量PCR擴增條件。擴增曲線：95 ℃ 5 min 1 循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s 40循環(huán)。熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。

所需熒光定量PCR引物為RLM1-F：GCAAACTGGTGCTCAAGG；RLM1-R：GGTCCCGAAGTAGGAAAGG。

2 結(jié)果與討論

2.1 NST1基因敲除序列制備

PCR擴增G418抗性基因的同時引入NST1基因同源臂，用于后續(xù)基因同源重組。以 QC-F、QC-R 為引物，利用 PCR 獲得帶有 2 個NST1同源臂和kanr篩選標(biāo)記基因片段，分析結(jié)果見圖1。由圖1可以發(fā)現(xiàn)，實驗得到片段大小與理論預(yù)計(1 800 bp)一致，該PCR 產(chǎn)物即為NST1基因敲除序列組件。

M—DL2000; 1—nst1Δ PCR產(chǎn)物

2.2 重組敲除菌株nst1Δ構(gòu)建與驗證

采用電擊轉(zhuǎn)化法將NST1基因敲除序列組件轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中。由于NST1基因敲除序列組件中包含異源顯性的kanr標(biāo)記，將構(gòu)建好的序列組件轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞后其兩端與酵母基因組同源的序列將引發(fā)同源重組替換，最終以loxp-Kanr-loxp取代基因組中的NST1從而賦予轉(zhuǎn)化子G418(遺傳霉素)抗性。2～3 d后可在含G418的平板上獲得轉(zhuǎn)化子(圖2)。

圖2 NST1基因敲除序列組件轉(zhuǎn)化

提取轉(zhuǎn)化子基因組，以A/Yz-a、B/Yz-b為引物，進行PCR擴增。正確整合了敲除組件的細(xì)胞使用引物A與YZ-a配對可得到200 bp左右產(chǎn)物，使用引物B與YZ-b可得到800 bp左右產(chǎn)物，如圖3所示。由圖3可知，轉(zhuǎn)化子驗證結(jié)果與理論值一致，并且測序結(jié)果亦顯示NST1基因敲除成功。

M—DL2000; 1—A-YZ-a PCR產(chǎn)物; 2—YZ-b-B PCR產(chǎn)物

2.3 回補菌株nst1Δ-NST1的構(gòu)建與驗證

將連接載體pUC18-nst1 電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入大腸感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB藍白篩培養(yǎng)基，過夜挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，核酸內(nèi)切酶雙酶切所提取質(zhì)粒，電泳結(jié)果如圖4(a)所示。將陽性克隆的片段送檢測序，驗證成功后，酶切膠回收構(gòu)建pYES2-nst1載體，并雙酶切后電泳分析，結(jié)果如圖4(b)所示。將正確構(gòu)建的pYES2-nst1載體電轉(zhuǎn)導(dǎo)入nst1Δ敲除菌感受態(tài)，提取轉(zhuǎn)化子基因組，pYES2通用引物PCR擴增，進行電泳分析，結(jié)果如圖4(c)所示。由圖4可知，回補菌株nst1Δ-NST1構(gòu)建成功。

M—DL5 000; 1—pUC18-NST重組載體酶切驗證;M′—DL10 000;1′—pYES2-NST1重組載體酶切驗證; M″—DL2 000;1″—pYES2通用引物驗證

2.4 重組菌株不同H2O2濃度的稀釋點滴實驗

將BY4741、nst1Δ敲除菌及nst1Δ-NST1回補菌接種于10 mL半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，加入PBS液使菌懸液OD600為1.0，進行稀釋梯度點滴實驗，依次吸取3 μL點滴于測試平板上，30 ℃倒扣培養(yǎng)3 d，觀察菌落生長情況,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，與對照菌BY4741相比，敲除菌對H2O2濃度更為敏感，在含4 mmol/L H2O2平板上，生長抑制明顯，回補之后生長有所恢復(fù)，說明NST1基因的敲除降低了酵母的抗氧化能力。

圖5 BY4741/nst1Δ/nst1Δ-NST1在不同H2O2濃度平板上的表型實驗(n=3,3 d)

2.5 氧化應(yīng)激下重組菌株生長速率比值的分析

圖6 BY4741、nst1Δ與nst1Δ-NST1在4 mmol/L H2O2下生長速率比

從圖6可知，在4 mmol/L H2O2YPD液體中，對照菌的生長速率比在78%左右，而敲除菌則下降至47%，與對照菌相比，敲除菌的生長明顯受到抑制，這結(jié)果表明NST1基因敲除確實降低了酵母抗氧化性能。Goossens等[19]研究發(fā)現(xiàn),NST1基因的敲除能夠增強酵母耐鹽能力。這可能是由于在高滲透壓脅迫下，酵母需要更多甘油作為一種可溶性有機溶劑，以維持胞內(nèi)外滲透壓平衡[21]，所以，NST1基因的敲除反而相對增強HOG途徑，表現(xiàn)出更強的耐鹽性。在氧化應(yīng)激下，細(xì)胞激活CWI途徑用以維持細(xì)胞壁完整性，NST1的缺失導(dǎo)致CWI補充途徑受到阻礙，增強了細(xì)胞的氧敏感性。

2.6 熒光顯微鏡檢測胞內(nèi)ROS

利用活性氧檢測試劑盒來測定對照菌和重組菌胞內(nèi)ROS水平。試劑盒采用熒光探針2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)進行活性氧檢測，DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH，生成有熒光的DCF。對實驗組和對照組進行處理后，熒光顯微鏡下觀察兩種菌在不同培養(yǎng)條件下的ROS水平，結(jié)果如圖7所示。

圖7 在4 mmol/L H2O2條件下胞內(nèi)ROS水平

由圖7可知，經(jīng)H2O2處理后，對照菌只有少許細(xì)胞胞內(nèi)含有ROS，而敲除菌幾乎是所有的細(xì)胞胞內(nèi)存在ROS。由此可見，NST1基因的敲除增加了酵母胞內(nèi)ROS水平。

2.7 熒光定量PCR測定CWI途徑下游基因轉(zhuǎn)錄水平

NST1基因編碼的蛋白作為一種HOG途徑的“補充途徑”加強了CWI途徑，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時，NST1可加強CWI途徑下游基因Slt2磷酸化狀態(tài)，促進下游因子RLM1的表達，維持細(xì)胞壁的完整性。為此，采用Q-PCR技術(shù)對CWI途徑中RLM1進行了基因轉(zhuǎn)錄水平測定，結(jié)果如圖8所示。

圖8 基因RLM1轉(zhuǎn)錄水平

由圖8可看出，在正常培養(yǎng)條件下，對照菌RLM1的表達水平上升到了423.3%，而敲除菌上升幅度相對變小，只有215.6%。由此，可以推測NST1的缺失影響了酵母CWI途徑下游RLM1基因的轉(zhuǎn)錄表達，其控制的大量涉及細(xì)胞壁合成的基因。細(xì)胞壁完整性得不到維持可能是敲除菌抗氧能力降低的主要因素。

3 結(jié)論

以釀酒酵母模式菌株BY4741為出發(fā)菌株，通過同源重組技術(shù)對酵母NST1基因敲除，命名為nst1Δ，并考察其抗氧化性能。與對照菌BY4741相比，敲除菌對H2O2濃度更為敏感，在4 mmol/L H2O2YPD液體培養(yǎng)中，敲除菌生長速率受到明顯抑制。胞內(nèi)ROS檢測結(jié)果亦說明NST1基因敲除增加了胞內(nèi)ROS水平。NST1作為“補充途徑”從HOG途徑方面加強CWI途徑以維持細(xì)胞壁完整性，實驗結(jié)果表明NST1基因的缺失降低了RLM1基因的表達水平。