甘草酸調(diào)控AMPK/ACC/SREBP信號通路改善胰島素抵抗的機制

欒 超，邵 蕾，石 惠，陳雪梅

(江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院 衛(wèi)生管理與基礎(chǔ)學院，江蘇 南京 211800)

胰島素抵抗(IR)是指機體對胰島素敏感性降低的一種病理狀態(tài)，主要表現(xiàn)在胰島素的靶組織(如肌肉、肝臟等)對胰島素的反應性和敏感性降低，從而導致對葡萄糖的攝取和利用減少，常常伴有脂質(zhì)分解障礙以及蛋白質(zhì)合成受損等情況[1]。胰島素抵抗既是引發(fā)代謝綜合征、糖尿病和心血管疾病的高危因素，又是這些疾病共同的病理生理基礎(chǔ)，給人類健康帶來嚴重危害。

據(jù)統(tǒng)計，現(xiàn)代人過多攝入高熱量食物，使肥胖的發(fā)生率明顯增加[2]，而肥胖誘發(fā)高游離脂肪酸血癥將會導致胰島素抵抗[3]，尤其是腹型肥胖者更為高發(fā)。因此，本實驗采用長期給予小鼠高脂飲食，誘導肥胖復制胰島素抵抗模型，模擬能量攝入過多而造成的胰島素抵抗，更加接近于人類飲食模式。

甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)為甘草的主要有效成分，是一種五環(huán)三萜系列皂苷，臨床被廣泛用作降血糖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗急慢性肝炎、抗支氣管炎及抗?jié)兊确矫鎇4]。Eu等[5]發(fā)現(xiàn):甘草酸可以恢復胰島素抵抗狀態(tài)下脂蛋白脂酶的活性，調(diào)節(jié)血脂紊亂，但是其具體作用機制不明。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是調(diào)節(jié)機體能量代謝的重要物質(zhì)，研究表明：多種天然化合物能激活AMPK，增強胰島素的敏感性，是改善胰島素抵抗的潛在靶點。因此，本研究擬觀察甘草酸對長期高脂飲食誘導的胰島素抵抗的調(diào)控作用，并觀察其對AMPK的影響，探究作用機制，以期為甘草酸的現(xiàn)代化應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J雄性小鼠50只，體質(zhì)量20～22 g，由南通大學動物中心提供，合格證號：SCXK(蘇)2014-0001。

1.2 藥物與試劑

甘草酸(純度98%)，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；胰島素試劑盒，美國Sigma公司；AMPK一抗、磷酸化AMPK一抗、ACC一抗、磷酸化ACC一抗、SREBP一抗和GAPDH一抗，美國Cell Signaling Technology(CST)公司；PVDF膜，美國Millipore公司。

1.3 實驗儀器

血糖儀，上海強生(中國)醫(yī)療器械有限公司；UniCel DxC800全自動生化儀，美國BECKMAN COULTER公司；H1650R型臺式高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；CX31型生物正置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Western SDS-Page電泳儀，美國Bio-Rad公司；MICROCHEMI化學發(fā)光凝膠成像儀，以色列DNR公司。

1.4 小鼠造模與給藥

根據(jù)參考文獻[6]造模，將小鼠隨機分成5組：正常組(LC)、模型組(HF)、二甲雙胍組(Met)、甘草酸低劑量組和甘草酸高劑量組，每組10只。除正常組外，其余組小鼠均給予高脂飲食，16周后，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量增加，血脂和血糖升高，糖耐量和胰島素耐量受損等胰島素抵抗的特征，從而判定造模成功。隨后給予相應藥物干預，正常組和模型組則給予等量生理鹽水灌胃。在藥物干預16周后，取血，分離血清測定甘油三酯(TC)、總膽固醇(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；小鼠脫椎處死，取出肝臟固定用于免疫印跡分析。

1.5 糖耐量試驗和胰島素耐量試驗

甘草酸干預第14周做糖耐量試驗，試驗前禁食12 h，小鼠尾部取血，使用血糖儀檢測空腹血糖(Blood Glucose,BG)0 min。稱量小鼠體質(zhì)量，腹腔注射葡萄糖溶液2 g/kg，隨后分別在30、60和120 min時間點取血，檢測血糖值(BG 30 min，BG 60 min和BG 120 min)。

甘草酸干預第15周做胰島素耐量試驗，試驗前禁食4 h，測空腹胰島素水平，腹腔注射胰島素0.75 U/kg，操作同糖耐量試驗。

1.6 Western blotting技術(shù)檢測肝臟AMPK、ACC和SREBP的表達

將小鼠肝臟組織用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取組織總蛋白，充分勻漿，4 ℃、12 000 r/min，離心 20min，收集上清液，BCA法進行總蛋白定量。采用SDS-PAGE凝膠電泳，每孔加入30 μg 蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%質(zhì)量分數(shù)脫脂奶粉室溫封閉1 h，置于AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌3次，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗室溫下孵育1 h，用TBST緩沖液洗滌3次，化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光成像。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果與討論

2.1 甘草酸對高脂飲食誘導小鼠血脂的影響

甘草酸對小鼠血脂的作用結(jié)果見表1。由表1可知：模型組(HF)小鼠的TG、TC、LDL-C明顯升高，HDL-C明顯降低，與正常組(LC)相比，具有極顯著差異(P<0.01)。與模型組(HF)相比，甘草酸高劑量組(HF+GA-100 mg/kg)和二甲雙胍組(HF+Met-250 mg/kg)小鼠的TG、TC和LDL-C明顯降低(P<0.05，P<0.01)，甘草酸低劑量組(HF+GA-50 mg/kg)小鼠TG明顯降低(P<0.05)。由此可知，甘草酸和二甲雙胍均能升高HDL-C水平，但沒有統(tǒng)計學意義。甘草酸能夠明顯降低TG、TC和LDL-C，一定程度上能導致HDL-C升高，改善高脂飲食誘導的血脂紊亂。

表1 甘草酸改善高脂飲食誘導的血脂代謝紊亂

2.2 甘草酸改善高脂飲食誘導的糖耐量異常

甘草酸對小鼠血糖的影響見表2。由表2可知：所有小鼠的血糖均在30 min達到最高峰，經(jīng)長期高脂飲食的小鼠與正常小鼠相比，各時間點的血糖均明顯升高，具有極顯著差異(P<0.01)。甘草酸高劑量組(HF+GA-100 mg/kg)和二甲雙胍組(HF+Met-250 mg/kg)小鼠在0、30、60和120min的血糖均降低，與模型組(HF)小鼠相比都有顯著差異(P<0.05，P<0.01)，而低劑量的甘草酸(HF+GA-50 mg/kg)作用并不明顯(P>0.05)。由此可知，甘草酸高劑量能明顯改善高脂飲食誘導的糖耐量異常。

表2 甘草酸改善高脂飲食誘導的糖耐量異常

2.3 甘草酸改善高脂飲食誘導的胰島素耐量異常

甘草酸對小鼠胰島素的影響見表3。由表3可知：與正常組(LC)相比，模型組(HF)小鼠在各個時間點的血清胰島素水平明顯升高，提示長期高脂飲食可造成小鼠胰島素水平紊亂，胰島素耐量異常。而二甲雙胍(HF+Met-250 mg/kg)和甘草酸高劑量(HF+GA-100 mg/kg)均能明顯降低各個時間點的小鼠血清胰島素水平，療效接近，與模型組(HF)相比，均具有顯著性差異(P<0.05,P<0.01)，甘草酸低劑量(HF+GA-50 mg/kg)能明顯降低高脂飲食小鼠0和120 min時的胰島素水平(P<0.05)，對30和60 min作用不明顯。提示甘草酸能明顯改善高脂飲食造成的胰島素耐量異常，提高機體對胰島素的敏感性。

表3 甘草酸改善高脂飲食誘導的胰島素耐量異常

2.4 甘草酸對高脂飲食小鼠肝臟AMPK/ACC/SREBP信號通路的影響

AMPK即AMP依賴的蛋白激酶，作為細胞的“能量調(diào)節(jié)器”，廣泛參與了機體能量的消耗及攝入，當AMPK被激活后，能明顯增加胰島素的敏感性，提高葡萄糖穩(wěn)態(tài)水平，促進蛋白質(zhì)和脂肪的合成，現(xiàn)已成為改善胰島素抵抗的重要靶點[7]。有研究表明：進行體育鍛煉、使用降糖藥物(雙胍類、噻唑烷二酮類等)，或者某些天然化合物均能激活AMPK，磷酸化乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)和乙酰輔酶A羧化酶2(ACC2)，從而抑制ACC酶的活性，減少丙二酸單酰輔酶A的含量，繼而減少脂肪酸的生物合成，并減少TG的合成，從而改善胰島素抵抗狀態(tài)[8]。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)，又被稱為脂肪細胞定向分化因子，可能具有生脂作用。有研究表明：SREBP是調(diào)控脂肪酸、甘油三酯和膽固醇合成的關(guān)鍵因子[9]，而人類脂肪生成的能力主要就受SREBP表達的影響[10]。AMPK通過下調(diào)脂肪酸合成的相關(guān)酶的活性，可以通過抑制脂質(zhì)生成有關(guān)的因子SREBP-1c、ChREBP的表達來抑制脂質(zhì)生成，在肝臟脂質(zhì)代謝異常的疾病中發(fā)揮著治療作用[11]。

甘草酸對AMPK/ACC/SREBP信號通路的影響見圖1。由圖1可知：與正常組(LC)相比，高脂飲食組(HF)小鼠AMPK和ACC的磷酸化水平以及SREBP的表達都出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)，提示長期高脂飲食能夠抑制AMPK/ACC/SREBP信號通路的活性。給予相應藥物干預之后，甘草酸低劑量(HF+GA-50 mg/kg)、甘草酸高劑量(HF+GA-100 mg/kg)和二甲雙胍(HF+Met-250 mg/kg)均可以顯著提高AMPK和ACC 的磷酸化水平，SREBP的表達也明顯增加，與模型組(HF)相比，具有顯著性差異(P<0.05)。

注：與LC相比，*表示P<0.05；與HF相比，#表示P<0.05。

3 結(jié)論

1)采用長期高脂飲食誘導小鼠肥胖，復制胰島素抵抗模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)血脂紊亂，表現(xiàn)為TC、TG和LDL-C升高，HDL-C降低，同時糖耐量與胰島素耐量均出現(xiàn)異常，表示造模成功，而且該模型更接近人類飲食中能量攝入過多造成的胰島素抵抗。

2)甘草酸能夠改善高脂飲食誘導的血脂紊亂，改善糖耐量與胰島素耐量異常，提高整個機體的胰島素敏感性，這可能與其激活AMPK/ACC/SREBP信號通路的表達有關(guān)。

本研究為甘草酸的現(xiàn)代化應用，特別是其在胰島素抵抗方面的應用提供了實驗依據(jù)。