王夢范，張丹丹

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266000)

姜黃素是從姜科植物中提取的一種化學(xué)成分，主要臨床作用有抗炎、抗氧化[1]、降血脂、治療腸道疾病[2]以及抗癌[3-4]等。

姜黃素存在水溶性差(0.03 μmol/L)[5]、體內(nèi)不易吸收而且易代謝等缺點(diǎn)，在臨床上還未被很好地開發(fā)利用?，F(xiàn)階段對姜黃素研究的重點(diǎn)是進(jìn)行劑型改造以提高其溶解性能[6]，進(jìn)而提高生物利用度。目前可以提高難溶性物質(zhì)溶解性的制劑技術(shù)有微囊化制劑技術(shù)[7]、包合物制劑技術(shù)[8]、脂質(zhì)體制劑技術(shù)[9]和納米粒制劑技術(shù)[10]等。

微球技術(shù)作為一種新制劑新技術(shù)，具有明顯的緩釋作用，能明顯提高藥物的生物利用度和穩(wěn)定性，并且對人體的刺激性小，體內(nèi)釋放速度緩慢，可以提高藥物的治療作用。本文中，筆者通過乳化溶劑擴(kuò)散法制備姜黃素微球，以單因素試驗(yàn)法和星點(diǎn)效應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)，以期得到最佳包封率處方，提高姜黃素生物利用度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

姜黃素(HPLC純度大于60%)，深圳恒生生物科技有限公司；乙基纖維素(藥用級)，泰安瑞泰纖維素有限公司；吐溫80(Tween80，化學(xué)純)、十二烷基硫酸鈉(化學(xué)純)，天津博迪化工股份有限公司；乙酸乙酯(化學(xué)純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇(化學(xué)純)，煙臺三和化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4(化學(xué)純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

IT-09A型磁力攪拌器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RCZ-8A型智能藥物溶出儀，天津大學(xué)精密儀器廠；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；LabTech型紫外分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器有限公司；XSP-2CA型生物顯微鏡，上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 姜黃素微球的制備

按照文獻(xiàn)[11]，精密稱量一定量的乙基纖維素溶于20 mL乙酸乙酯中，加入0.1 g姜黃素溶解，為油相；向乙酸乙酯的水飽和溶液中加入一定量的吐溫80，攪拌均勻，為水相。設(shè)置轉(zhuǎn)速(550～800 r/min)、攪拌時(shí)間(30～150 min)等條件，向水相中緩慢加入油相，繼續(xù)攪拌得姜黃素微球乳液。向制備好的微球乳液中緩慢加入大量水(體積為乙酸乙酯的8倍)，使乙酸乙酯充分?jǐn)U散到水中，將姜黃素微球沉淀出來，靜置0.5 h，過濾，并用水沖洗，烘干即得姜黃素微球。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

根據(jù)姜黃素微球的制劑處方，對影響微球性能的因素如乙基纖維素與姜黃素的質(zhì)量比、吐溫80的用量、磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速、攪拌時(shí)間及油相水相體積比等設(shè)計(jì)了5個因素的試驗(yàn)，且每個因素下設(shè)5個水平，以包封率為評價(jià)指標(biāo)篩選最佳制備工藝。

1.3.3 星點(diǎn)試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)中，對包封率影響較大的因素為乙基纖維素與姜黃素的質(zhì)量比(X1)、吐溫80的用量(X2)和水相油相的體積比(X3)。單因素試驗(yàn)選擇的優(yōu)化范圍為m(乙基纖維素)∶m(姜黃素)=(15～25)∶ 1、吐溫80用量為10～30 mg/mL、V(水相)∶V(油相)=(1～3)∶ 1。因此，對這3個因素進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)5水平，優(yōu)化制備工藝。各因素的5水平見表1。

表1 因素水平表

1.3.4 微球載藥量及包封率的測定

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。配制30 μg/mL的姜黃素乙醇溶液作為儲備液。精密移取一定量的儲備液，用無水乙醇配制2.25、3.00、3.75、4.50、5.25和6.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以無水乙醇為空白對照，在423 nm[12]的波長下用紫外分光光度計(jì)測定吸光值A(chǔ)423，然后以姜黃素質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)423(y)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為y=0.093 16x+0.018 1(R2=0.999)，在2.25～6.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2)姜黃素微球載藥量及包封率的測定。精密稱取等量姜黃素微球于燒杯中，加入適量的無水乙醇，超聲溶解后轉(zhuǎn)移至容量瓶中，定容。以無水乙醇為空白對照，在423 nm的波長下測定吸光值A(chǔ)423，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算出微球中姜黃素的含量，再根據(jù)藥物含量得出微球的載藥量和包封率，具體計(jì)算見式(1)～(2)。

載藥量=微球中藥物的量/微球的質(zhì)量×100%

(1)

包封率=微球中藥物的量/投入藥量×100%

(2)

1.3.5 微球體外釋放度試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[13]中“釋放度測定第二法(槳法)測定釋放度”，設(shè)置轉(zhuǎn)速75 r/min、溫度37 ℃、溶出介質(zhì)體積500 mL，測定姜黃素對照品與姜黃素微球在人工胃液(含有0.2%的十二烷基硫酸鈉)中的釋放度。在0.5、1、2、3、4、6、8、10和12 h時(shí)取樣，過濾，測吸光值，計(jì)算累積釋放度，繪制釋放度曲線。

1.3.6 微球形態(tài)觀察

在光學(xué)顯微鏡下觀察姜黃素微球形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙基纖維素與姜黃素的質(zhì)量比對包封率的影響

考察乙基纖維素與姜黃素的質(zhì)量比對包封率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙基纖維素與姜黃素的質(zhì)量比對包封率的影響

由圖1可知:隨著乙基纖維素比例的增大，姜黃素微球的包封率逐漸增大，當(dāng)m(乙基纖維素)∶m(姜黃素)為20∶ 1時(shí)，包封率最大，為88.12%；隨著乙基纖維素的比例再增大，包封率反而降低，可能是乙基纖維素用量過大時(shí)，制備的微球粒徑較大，部分原材料黏連，造成微球成型困難，包封率低。

2.1.2 吐溫80用量對包封率的影響

吐溫80在處方中作為乳化劑使用，降低表面張力使油相和水相均勻分散，使微球粒徑均勻。因此，考察吐溫80用量對包封率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：隨著吐溫80用量的增大，姜黃素微球的包封率先增大后減小，當(dāng)吐溫80用量為20 mg/mL時(shí)，包封率最大，為84.16%；隨著吐溫80濃度再增大，包封率反而降低，可能是吐溫80用量變大使得微球粒徑變小，比表面積變大，囊材不足以包封所有藥物，導(dǎo)致包封率降低。

圖2 吐溫80用量對包封率的影響

2.1.3 轉(zhuǎn)速及對包封率的影響

考察轉(zhuǎn)速對包封率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，轉(zhuǎn)速為550～600 r/min時(shí)，包封率略有增大，但轉(zhuǎn)速為600～800 r/min時(shí)，包封率變化較小。由此可見，轉(zhuǎn)速為600 r/min時(shí)，包封率最佳(86.82%)，因此選擇600 r/min作為姜黃素微球制備時(shí)的最佳轉(zhuǎn)速。

圖3 轉(zhuǎn)速對包封率的影響

2.1.4 攪拌時(shí)間對包封率的影響

考察攪拌時(shí)間對包封率的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)攪拌時(shí)間在30～150 min時(shí)，對包封率的影響較小，包封率為82.22%～89.22%。同時(shí)，考慮到節(jié)約成本，選擇30 min作為姜黃素微球制備時(shí)的最佳攪拌時(shí)間。

圖4 攪拌時(shí)間對包封率的影響

2.1.5 水相油相體積比對包封率的影響

考察水相油相體積比對包封率的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在水相油相體積比為1時(shí)，包封率最大，為88.36%，但水相體積再增大時(shí)包封率降低，可能是水相體積過大，相同的轉(zhuǎn)速條件下攪拌不夠充分，使包封率降低將此結(jié)果作為考察依據(jù)，選擇星點(diǎn)試驗(yàn)優(yōu)化范圍為V(水相)∶V(油相)為(1～3)∶ 1。

圖5 水相與油相的體積比對包封率的影響

2.2 效應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型的建立與效應(yīng)面結(jié)果分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果中影響因素較大的為乙基纖維素與姜黃素的質(zhì)量比(X1)、吐溫80的用量(X2)和油相水相的體積比(X3)，因此，以包封率為評價(jià)指標(biāo)(即響應(yīng)值)，確定最優(yōu)制備處方，結(jié)果如表2所示。

表2 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件，以包封率為因變量(Y)，乙基纖維素與姜黃素的質(zhì)量比(X1)，吐溫80的用量(X2)，油相和水相的體積比(X3)為自變量，進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，可得包封率(Y)對各自變量二次多項(xiàng)回歸方程：Y=93.53+0.72X1+1.41X2-3.63X3-3.2392-2.65X22-X32(R2=0.980 6)。由此可知，采用二次多項(xiàng)式擬合較為準(zhǔn)確。二次多項(xiàng)式擬合方差分析及可靠性分析見表3及表4。

由表3可知，模型的P<0.000 1，表明該二次多項(xiàng)式方程的顯著性極高，可正確反映乙基纖維素與姜黃素的質(zhì)量比(X1)、吐溫80的用量(X2)和水相油相的體積比(X3)之間的關(guān)系。失擬項(xiàng)(Lack of Fit)為0.375 8>0.05，說明該回歸方程與試驗(yàn)結(jié)果的擬合度較高[14]。X1、X2、X3、X1X2、X12、X22和X32的P值均小于0.05，表明各因素對姜黃素包封率的影響顯著。表4中變異系數(shù)為1.17，這表明模型穩(wěn)定。

表3 包封率回歸模型方差分析

表4 回歸方程的可靠性分析

表3中，各變量F值越大，表明對微球的包封率影響越大，各因素對包封率的影響由大到小為C、B、A，即水相油相體積比，吐溫80用量，乙基纖維素與姜黃素質(zhì)量比。

2.2.2 效應(yīng)面分析與條件優(yōu)化

運(yùn)用Design-Expert 8.0描繪因變量和自變量的三維效應(yīng)面和二維等高圖，各因素交互作用的結(jié)果見圖6。

圖6 各因素對姜黃素微球包封率的效應(yīng)面圖

由圖6可知，3D效應(yīng)曲面圖顯示了最大值和最小值區(qū)域，各因素對包封率的影響越大，曲面越陡峭，各因素的最佳值為X1為20.04、X2為21.68、X3為1.47。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

將星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的最佳值X1為20.04、X2為21.68、X3為1.47，代入處方，設(shè)計(jì)驗(yàn)證試驗(yàn)，制備3批姜黃素微球，在光學(xué)顯微鏡下觀察姜黃素微球的形態(tài)，并計(jì)算包封率和載藥量，進(jìn)行體外釋放度試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，優(yōu)化后的姜黃素微球的制備工藝水平明顯提高，包封率較高，與預(yù)測值較為接近，且偏差較小，說明星點(diǎn)試驗(yàn)效應(yīng)面優(yōu)化的處方條件可行。

2.4 載藥量及累積釋放度

測定驗(yàn)證批微球的載藥量，結(jié)果見表6。

表6 載藥量及累積釋放度

由表6可知，3批姜黃素微球的平均載藥量為7.52%，累積溶出度在6 h時(shí)達(dá)平衡，12 h時(shí)平均釋放度為83.11%，與原料藥相比，有良好的緩釋效果。

2.5 微球形態(tài)觀察

在光學(xué)顯微鏡下觀察姜黃素微球形態(tài)，結(jié)果見圖7。由圖7可知，微球形態(tài)圓整、大小較均勻，粒徑范圍為20～80 μm。

圖7 姜黃素微球形態(tài)(×100)

3 結(jié)論

采用乳化溶劑擴(kuò)散法制備姜黃素微球，通過單因素試驗(yàn)初步優(yōu)化制備工藝，利用單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)星點(diǎn)試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化制備工藝。星點(diǎn)設(shè)計(jì)所得到的最佳制備處方為乙基纖維素與姜黃素的質(zhì)量比為20.04、吐溫80的用量為21.68 mg/mL、油相水相體積比為1.47，制備的姜黃素微球的質(zhì)量最佳，即微球形態(tài)圓整、大小較均勻，包封率高達(dá)93.66%，載藥量在7%以上，并且通過體外釋放度試驗(yàn)證明了本試驗(yàn)所制備的姜黃素微球具有明顯的緩釋作用。