超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定運(yùn)動(dòng)型乳飲品中的氨基酸

尤佳麗

（1.河南科技大學(xué)應(yīng)用工程學(xué)院，河南三門峽472000；2.三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南三門峽472000）

0 引 言

運(yùn)動(dòng)型乳飲品是指添加一種或多種氨基酸，一定程度上可以調(diào)節(jié)人體功能的飲品。因其添加的氨基酸能被人體直接吸收，其效果比補(bǔ)充蛋白質(zhì)類的營養(yǎng)品效果快，比較受消費(fèi)者的喜愛[1-3]。但是此類飲品的市場龐大，種類繁多[4-6]，有必要分析其中氨基酸的種類以及含量，以便保障人們科學(xué)、定量地?cái)z入氨基酸。

常見的氨基酸分析方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法等[7-16]。本研究依據(jù)質(zhì)譜儀器的特點(diǎn)，運(yùn)用HLB小柱簡化提取過程，建立固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定運(yùn)動(dòng)型乳飲品中Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸，可為運(yùn)動(dòng)型乳飲品中多種氨基酸同時(shí)檢測提供技術(shù)支持和參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（AB6010），四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（AI2000）。

標(biāo)準(zhǔn)品Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr。

1.2 樣品來源

實(shí)驗(yàn)所用的運(yùn)動(dòng)型乳飲品均是隨機(jī)購于市場上。

1.3 超液相色譜條件

色譜柱為Acclaim Explosive E2(2.1mm×150mm，3μm)；流動(dòng)相A為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.10%甲酸溶液，B為甲醇；流動(dòng)相梯度洗脫程序如表1所示。

1.4 方法

1.4.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對(duì)質(zhì)譜的各個(gè)參數(shù)的選擇，選用ESI+模式，采用分別進(jìn)樣的方式，對(duì)Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸的每個(gè)物質(zhì)的定性離子和定量離子進(jìn)行確定。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以濃度為0.1 mol/L的鹽酸溶解Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，并定容到10 mL，得到氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度均為100μmol/L。以此為儲(chǔ)備液，配制一系列的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 樣品前處理方式的優(yōu)化

由于運(yùn)動(dòng)型乳飲品中的基質(zhì)主要含有蛋白質(zhì)以糖類等基質(zhì)[17-20]，本研究比較了兩種前處理方式對(duì)樣品檢測的影響，并對(duì)固相萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及樣品測定

在運(yùn)動(dòng)型乳飲品中加入Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，計(jì)算回收率；并選擇5種常見的運(yùn)動(dòng)型乳飲品，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件和儀器條件，對(duì)其中的氨基酸含量及種類進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

本研究在參考其他文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[21-26]，選用采用Acclaim Explosive E2色譜柱來分離16種氨基酸，效果比較理想，色譜峰的峰形較好。此外，本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相選擇甲醇-0.10%甲酸銨溶液時(shí)，色譜峰形較好，質(zhì)譜響應(yīng)較高，結(jié)果如圖1所示。

圖1 16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別對(duì)濃度為100μmol/L的Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，如表2所示。

依照表2所設(shè)定質(zhì)譜的條件，16種氨基酸的MRM圖如圖2所示。

表2 16種氨基酸的多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)

圖2 16種氨基酸的MRM

表3 16種氨基酸的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

對(duì)Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸的線性方程的繪制，如表3所示。由表3可以看出，16種氨基酸在濃度為0.10～10.00μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2為0.9924～0.9993，檢出限范圍為0.005～0.05μmol/L，定量限范圍為0.03～0.20μmol/L。

2.4 前處理方式的優(yōu)化

在對(duì)運(yùn)動(dòng)型乳飲品中的Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr不同提取方式對(duì)目標(biāo)物的提取有很大影響，以標(biāo)稱含有多種氨基酸的運(yùn)動(dòng)型乳飲品為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，比較了兩種不同的方式。方式Ⅰ：樣品以10%乙醇作為提取劑，提取后離心，上清液上機(jī)檢測；方式Ⅱ：樣品經(jīng)SPE小柱凈化，再經(jīng)過淋洗和洗脫后上機(jī)檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，經(jīng)固相萃取小柱Oasis PRiME HLB處理過的樣品液中干擾物明顯減少。這是由于SPE小柱中的材料對(duì)運(yùn)動(dòng)型乳飲品中雜質(zhì)有吸附作用，能將樣品中目標(biāo)物有效的通過，而截留樣品中的雜質(zhì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和精確性有很大的提高；而以體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇沉淀運(yùn)動(dòng)型乳飲品的蛋白質(zhì)，很難將樣品中的干擾物清除完全。因此，本方法選擇Oasis PRiME HLB處理過為適宜的前處理方式。

2.5 固相萃取小柱萃取條件的優(yōu)化

2.5.1 洗脫液的選擇

依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果選用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱對(duì)運(yùn)動(dòng)型乳飲品中16種氨基酸進(jìn)行凈化和富集，在對(duì)小柱的洗脫液方面分別比較了超純水、25%，50%，75%，100%的甲醇溶液（體積分?jǐn)?shù)）等5種溶液的洗脫效果，結(jié)果以16種氨基酸的平均回收率為比較依據(jù)，結(jié)果如圖4所示。

圖3 兩種處理方式的色譜圖比較

圖4 洗脫液對(duì)16種氨基酸平均回收率的影響

由圖4可以看出，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，16種氨基酸平均回收率比較高，此時(shí)體積分?jǐn)?shù)為25%甲醇的溶液洗脫能力較強(qiáng)，能較完全地洗脫目標(biāo)物，所以本研究選擇體積分?jǐn)?shù)為25%的甲醇溶液作為樣品的洗脫液。

2.5.2 洗脫液體積的選擇

在上述選用體積分?jǐn)?shù)為25%甲醇作為Oasis PRiME HLB固相萃取小柱洗脫液的基礎(chǔ)上，比較了洗脫液體積對(duì)16種氨基酸平均回收率的影響。進(jìn)分別比較了超純水1，2，3，4，5 mL等5種體積對(duì)目標(biāo)物洗脫效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，隨著洗脫液體積不斷增加，16種氨基酸平均回收率逐漸升高，但洗脫液體積達(dá)到3 mL以后再增加洗脫劑體積，回收率并沒有明顯增加，此時(shí)HLB固相萃取小柱中的目標(biāo)物較完全地被洗脫出，再增加洗脫液體積對(duì)目標(biāo)物回收率影響不大，所以選擇3 mL為洗脫體積較合適。

2.6 加標(biāo)回收與相對(duì)偏差

對(duì)Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，設(shè)定3個(gè)梯度濃度，每個(gè)梯度測定5次，結(jié)果如表4所示。

圖5 洗脫液體積對(duì)16種氨基酸平均回收率的影響

表4 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

表5 樣品中16種氨基酸的測定(n=5) mg/100mL

由表4結(jié)果可知，16種氨基酸的3個(gè)梯度加標(biāo)回收率范圍為85.1%～96.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～5.2%，表明建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

2.7 樣品的測定

本研究對(duì)市場上常見的5種常見的運(yùn)動(dòng)型乳飲品進(jìn)行16種氨基酸含量的測定，每個(gè)結(jié)果平均測定5次，具體結(jié)果如表5所示。

由表5可以看出，從市場上隨機(jī)抽取的樣品的質(zhì)量差別很大，也可以看出不同種類的運(yùn)動(dòng)型乳飲品中含有的氨基酸的種類和含量差異較大，5款飲品中都含有Glu；而Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Met，His，Phe，Arg這13種氨基酸只有個(gè)別樣品中有；而Gly和Tyr在這5種樣品中沒有添加，整體氨基酸檢測到的種類與產(chǎn)品外包裝標(biāo)簽中標(biāo)出的一致。針對(duì)分析測定的結(jié)果，我們可以根據(jù)自身的需要，選用不同類型的運(yùn)動(dòng)型乳飲品，來補(bǔ)充全面的或者單一的氨基酸，這樣會(huì)達(dá)到更有效的補(bǔ)充目的。

3 結(jié) 論

本研究建立的SPE-UPLC-MS/MS檢測運(yùn)動(dòng)型乳飲品中Gly，Ala，Ser，Pro，Val，Thr，Ile，Leu，Asp，Lys，Glu，Met，His，Phe，Arg，Tyr等16種氨基酸分析的方法。結(jié)果表明，樣品經(jīng)過Oasis PRiME HLB固相萃取小柱后，運(yùn)動(dòng)型乳飲品中雜質(zhì)和干擾物質(zhì)可有效地被去除，能準(zhǔn)確快速有效地檢測運(yùn)動(dòng)型乳飲品中16種氨基酸。并由實(shí)際樣品的檢測結(jié)果可知，整體氨基酸檢測到的種類與產(chǎn)品外包裝標(biāo)簽中標(biāo)出的一致。針對(duì)分析測定的結(jié)果，我們可以根據(jù)自身的需要，選用不同類型的運(yùn)動(dòng)型乳飲品，來補(bǔ)充全面的或者單一的氨基酸，這樣會(huì)達(dá)到更有效的補(bǔ)充目的。