徐倩 李紓( 通訊作者)

（山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院＜山東省口腔組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室＞＜山東省口腔生物材料與組織再生工程實(shí)驗(yàn)室＞ 山東 濟(jì)南 250012）

齲齒是人類口腔常見疾病，齲病的發(fā)生嚴(yán)重影響人們的身體健康，尤其是兒童[1-3]，因此全面分析齲病發(fā)生的成因并及早預(yù)防治療具有非常重要的意義[4]。將齲齒制成石蠟切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察是齲齒研究中一種常用手段，牙齒本身硬度較高，制成石蠟切片過程中需要對(duì)其進(jìn)行脫鈣處理，這一過程往往會(huì)浪費(fèi)數(shù)月的時(shí)間，以EXAKT 硬組織切磨系統(tǒng)為代表的硬組織切磨技術(shù)則解決了這一問題。該技術(shù)無需脫鈣，將不能用常規(guī)方法制備成組織切片的特有軟硬組織標(biāo)本制成組織切片，并保持組織本身原有的組織形態(tài)[5]。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)組織 人齲齒

1.1.2 儀器 德國(guó)EXAKT 組織切磨系統(tǒng)：組織切片機(jī) 組織磨片機(jī) 載片真空吸附裝置 光固化包埋機(jī) 組織脫水浸潤(rùn)儀 數(shù)顯千分尺等。

1.2 方法

將齲齒清洗干凈后置于多聚甲醛溶液固定48 小時(shí)，流水沖洗過夜，經(jīng)過酒精上行脫水和光固化樹脂浸潤(rùn)，光聚合法包埋成樹脂包埋塊，利用EXAKT 硬組織切磨系統(tǒng)將包埋塊進(jìn)行切片并打磨至50μm 的薄片，經(jīng)過甲苯胺藍(lán)染色后自然干燥，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)[6]。

甲苯胺藍(lán)染色：鐵蘇木素AB 液1 ∶1 混合，染色5 min(現(xiàn)用現(xiàn)配)，流水沖洗5min，甲苯胺藍(lán)染色50s，流水沖洗至合適的顏色。

2.結(jié)果

不同齲壞程度的牙齒硬組織切片甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

切片經(jīng)過甲苯胺藍(lán)染色后，牙釉質(zhì)呈淺黃色，牙本質(zhì)呈藍(lán)色。未齲壞的正常牙齒切片后可見完整的牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)（圖1a），淺齲牙齒可見牙釉質(zhì)表面發(fā)生輕度齲壞（圖1b），中齲牙齒可見齲壞已穿透牙釉質(zhì)發(fā)展至牙本質(zhì)線層（圖1c），深齲牙齒可見牙釉質(zhì)已經(jīng)缺失，齲壞已經(jīng)發(fā)展至牙本質(zhì)深層（圖1d）。

圖1 不同齲壞階段的齲齒組織切片-甲苯胺藍(lán)染色

3.討論

常規(guī)組織石蠟切片是組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較為廣泛的一種制片技術(shù)，在細(xì)胞和軟組織的病理學(xué)診斷中具有重要的意義[7]。石蠟切片對(duì)組織的硬度有要求，牙齒、骨組織等硬組織需要進(jìn)行脫鈣處理，以降低組織的硬度。酸類脫鈣劑脫鈣速度快，但是對(duì)組織的破壞性較大；螯合類脫鈣劑乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid EDTA）對(duì)組織的破壞性較小，是應(yīng)用較為廣泛的脫鈣劑，但是脫鈣周期較長(zhǎng)，一般為數(shù)周至數(shù)月[8]。硬組織切片技術(shù)作為近年來快速發(fā)展的新興技術(shù)，由于其無需脫鈣，既縮短了制片周期又保護(hù)了組織的完整性，因高效快捷而被迅速推廣應(yīng)用[9-12]。

選取了不同齲壞階段的齲齒作為制片樣本，分別為未發(fā)生齲壞的正常牙齒、淺齲牙齒、中齲牙齒和深齲牙齒。利用硬組織切片技術(shù)將各個(gè)齲齒制作成薄切片，經(jīng)過甲苯胺藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察可見齲壞在牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)發(fā)展的程度。硬組織切片技術(shù)可在包埋塊上連續(xù)切片，工藝精準(zhǔn)且無需脫鈣節(jié)省了大量時(shí)間。EXAKT 硬組織切磨系統(tǒng)的切割帶鋸含有金剛石顆粒，磨片用的砂紙含有碳化硅顆粒，可以切割硬度較高及含有植入物的組織塊，比如含有金屬種植釘?shù)墓墙M織、含有支架的血管肌肉組織等，切片厚度均一，劃痕少穩(wěn)定性高，組織結(jié)構(gòu)形態(tài)保持完好，染色后顏色均勻，在光學(xué)顯微鏡下和電鏡下均可觀察，還可用于切割纖維樁等材料。硬組織切片目前開發(fā)的染色方法較多，常用的有甲苯胺藍(lán)染色、蘇木素-伊紅染色、Van-Gieson 染色、Ladewig 染色、Giemsa 染色等，通過顏色、位置、骨界面定量分析等可以觀察牙結(jié)石、齲病的發(fā)生、種植體與骨組織的結(jié)合、新骨生成、血管炎癥反應(yīng)等。

硬組織切片技術(shù)應(yīng)用廣泛，但制作含有特殊材料種植體骨組織切片時(shí)仍有困難，比如氧化鋯陶瓷種植體。氧化鋯陶瓷硬度極高，如果種植體是結(jié)晶顆粒粘合而成，質(zhì)地比較疏松，配套的砂紙可以將其打磨變薄，但相比其它種植體需打磨更長(zhǎng)時(shí)間；如果種植體是整塊結(jié)晶制成，則需借助特殊研磨料才能將其打磨變薄，耗費(fèi)大量時(shí)間且容易破壞骨結(jié)合，影響結(jié)果分析。硬組織切片的免疫組化技術(shù)是另一個(gè)亟待解決的難關(guān)。免疫組織化學(xué)技術(shù)是根據(jù)免疫學(xué)的基本原理-抗原抗體反應(yīng)來確定組織細(xì)胞內(nèi)的抗原，對(duì)其進(jìn)行定位、定性、定量的技術(shù)。原有的包埋劑7200 將組織塊進(jìn)行包埋后，組織細(xì)胞內(nèi)的抗原信號(hào)因化學(xué)反應(yīng)被破壞，無法進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，現(xiàn)在已有升級(jí)版的包埋劑9100 可以解決這一問題，包埋劑9100 不會(huì)破壞遮蓋抗原信號(hào)，為后期的抗原抗體反應(yīng)提供條件。切片在進(jìn)行免疫組化反應(yīng)之前需進(jìn)行脫塑處理，使抗原抗體充分接觸反應(yīng)，但是現(xiàn)行的脫塑方法極易導(dǎo)致脫片，脫片后組織皺縮變形，原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，植入物與組織極易分離，無法彌補(bǔ)。為解決這一問題，硬組織切片技術(shù)在積極改進(jìn)脫塑技術(shù)以減少脫片概率，或者改良制片方法，使切片不用脫塑直接進(jìn)行免疫組化反應(yīng)。如果能克服這一難關(guān)，硬組織切片技術(shù)必將邁進(jìn)一大步，在組織工程研究領(lǐng)域作出更大的貢獻(xiàn)。

綜上所述，EXAKT 硬組織切磨技術(shù)無需脫鈣，可以將不同齲壞程度的齲齒制成組織薄切片，片子厚度均一，經(jīng)過拋光工藝劃痕少穩(wěn)定性高，經(jīng)過染色后在光學(xué)顯微鏡下可以清晰的看到齲壞在牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)中的發(fā)展程度，在齲壞觀察等口腔組織工程研究領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。