付應(yīng)霄，毛穎基，牛德群，黃銀久

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽蚌埠 233030；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

人體骨量的維持有賴(lài)于破骨細(xì)胞(osteoclast)主導(dǎo)的骨骼吸收過(guò)程以及成骨細(xì)胞(osteoblast)主導(dǎo)的骨骼形成過(guò)程[1]。機(jī)體骨骼吸收異常加劇則易導(dǎo)致其總量流失過(guò)度，進(jìn)而可能引發(fā)骨質(zhì)疏松癥、Paget’s，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等溶骨性疾病[2]。骨骼吸收的速率一定程度上取決于破骨細(xì)胞的數(shù)量與蝕骨功能，然而其數(shù)量與蝕骨功能受多種復(fù)雜因素的調(diào)節(jié)，因此，確定相關(guān)因素及其作用機(jī)理顯得尤為關(guān)鍵。

microRNAs能夠調(diào)控破骨細(xì)胞分化與活性[3]，但該領(lǐng)域研究尚待深入。筆者前期通過(guò)miRNA表達(dá)譜分析(由中國(guó)上海KangChen Bio-tech完成)發(fā)現(xiàn)，與破骨細(xì)胞前體相比較，分化破骨細(xì)胞內(nèi)miR-185-3p 表達(dá)水平上調(diào)極顯著(P<0.01)，此結(jié)果提示，miR-185-3p可能影響破骨細(xì)胞的分化過(guò)程，本研究將系統(tǒng)研究miR-185-3p對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1RAW264.7細(xì)胞株 購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)(上海生命科學(xué)研究院)。

1.1.2主要試劑 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)與MEM-α (Minimum essential medium α)細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(GE Healthcare，美國(guó))；M-CSF(Macrophage colony stimulating factor，巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，核因子 kappa-B 活化因子配基) (PeproTech，美國(guó))；TRAP(Tartrate resistant acid phosphatase，抗酒石酸酸性磷酸酶)染色試劑盒(Sigma-Aldrich，美國(guó))；COAS(Corning Osteo Assay Surface)吸收活性分析多孔培養(yǎng)板；miRNA-185-3p引物、U6引物、All-in-One miRNA qRT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction)檢測(cè)試劑盒(GeneCopoeia，美國(guó))；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen Corporation，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng) 復(fù)蘇RAW264.7細(xì)胞并培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基 (含10 % FBS、青霉素+鏈霉素)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞重懸于MEM-α培養(yǎng)液 (含10 % FBS、青霉素+鏈霉素)，并接種至細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞貼壁換含25 ng/mL M-CSF + 100 ng/mL RANKL的MEM-α培養(yǎng)液 (含10 %FBS、青霉素+鏈霉素)，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.2RNA提取與miR-185-3p表達(dá)水平檢測(cè) 培養(yǎng)結(jié)束，收集RAW264.7細(xì)胞與M-CSF + RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞(已分化細(xì)胞)，提取總RNA。測(cè)定并調(diào)整RNA濃度，運(yùn)用All-in-One miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞與誘導(dǎo)分化細(xì)胞內(nèi)miRNA-185-3p表達(dá)水平。

1.2.3miR-185-3p 模擬物(mimics)與阻遏物轉(zhuǎn)染(inhibitors) RAW264.7細(xì)胞接種并貼壁生長(zhǎng)，運(yùn)用Lipofectamine 2000 將miR-185-3p 模擬物與阻遏物轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，6 h后更換含M-CSF + RANKL的MEM-α培養(yǎng)液。

1.2.4TRAP染色及計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)設(shè)置miR-185-3p 模擬物與阻遏物轉(zhuǎn)染的M-CSF + RANKL誘導(dǎo)組與M-CSF + RANKL誘導(dǎo)組。培養(yǎng)結(jié)束吸棄培養(yǎng)基，采用4 %多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，10 min后棄去固定液，超純水清洗樣品，棄盡殘液，加入預(yù)配染色液，37 ℃染色50-60 min。染色結(jié)束，倒置顯微鏡觀察、拍照并計(jì)數(shù)≥3個(gè)核的破骨細(xì)胞。

1.2.5吸收活性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)設(shè)置miR-185-3p 模擬物與阻遏物轉(zhuǎn)染的M-CSF + RANKL誘導(dǎo)組與M-CSF + RANKL誘導(dǎo)組。細(xì)胞接種于COAS培養(yǎng)板，培養(yǎng)結(jié)束。取COAS培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)基，超純水沖洗孔底。加入10 %次氯酸溶液，室溫放置5 min。超純水沖洗，自然晾干后倒置顯微鏡觀察吸收陷窩，并計(jì)算面積。

2 結(jié)果

2.1miR-185-3p表達(dá)水平變化 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果表明，M-CSF + RANKL誘導(dǎo)分化細(xì)胞內(nèi)miRNA-185-3p表達(dá)水平顯著高于RAW264.7細(xì)胞(P<0.05)。該結(jié)果與前期miRNA表達(dá)譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。見(jiàn)圖1，表1。

表1 分化破骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞前體差異表達(dá)miRNA(mmu-miR-185-3p)

2.2miR-185-3p 影響破骨細(xì)胞分化形成 對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色，結(jié)果可見(jiàn)分化形成的多核細(xì)胞體積大、鋪展明顯、胞質(zhì)呈現(xiàn)酒紅色、胞核無(wú)色(圖2A)。細(xì)胞計(jì)數(shù)表明，與M-CSF+RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)組(8.67±1.70)相比較，miR-185-3p模擬物轉(zhuǎn)染組(12.33±1.27)破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P<0.05)，而miR-185-3p阻遏物轉(zhuǎn)染組(3.67±0.61)破骨細(xì)胞數(shù)量極顯著減少(P<0.01)(圖2B)。

2.3miR-185-3p 影響破骨細(xì)胞吸收活性 統(tǒng)計(jì)表明，miR-185-3p模擬物轉(zhuǎn)染組吸收陷窩面積(96 058.99±29 837.22)μm2顯著大于M-CSF+RANKL組的(34 985.92±13 440.78)μm2(P<0.05)，而miR-185-3p阻遏物轉(zhuǎn)染組(2 997.89±947.90)μm2則顯著小于M-CSF+RANKL組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

破骨細(xì)胞形成與功能的關(guān)鍵鑒定指標(biāo)是其分化形態(tài)與吸收活性[1]。本文發(fā)現(xiàn)miR-185-3p模擬物轉(zhuǎn)染組破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多吸收活性增強(qiáng)，而miR-185-3p阻遏物轉(zhuǎn)染組破骨細(xì)胞數(shù)量極顯著減少且吸收活性減弱。表明，miR-185-3p 能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化形成。

Dgcr8(DGCR8, DiGeorge syndrome critical region gene 8)，Dicer和Ago2(Argonaute 2)是miRNAs維持穩(wěn)態(tài)和發(fā)揮功能的關(guān)鍵因素。通過(guò)小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)沉默破骨細(xì)胞前體中Dgcr8, Dicer, 或者Ago2基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞的分化形成和功能均受到顯著影響。在miRNA缺陷的破骨細(xì)胞前體呈現(xiàn)出破骨細(xì)胞分化和活化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如PU.1，Mitf(microphthalmia-associated transcription factor)，F(xiàn)os和Nfatc1(nuclear factor of activated T cells)等表達(dá)水平下調(diào)的現(xiàn)象，表明miRNAs能夠影響破骨細(xì)胞的形成與活性[4]。

多種miRNAs可能通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞分化與活化過(guò)程的靶基因或相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而影響破骨細(xì)胞的形成或功能。如hsa-miR-422a、hsa-miR-148a-3p、miR-31-5p、miR-29、miR-183-5p、miR-214-3p等可促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和活化；而miR-26a-5p、miR-34a-5p、miR-124-3p、miR-125a-5p、miR-503-5p等則抑制破骨細(xì)胞的分化和活化；另外，miR-223-3p、hsa-miR-133a-3p、miR-21-5p等對(duì)破骨細(xì)胞的分化和活化兼具促進(jìn)和抑制雙重影響[5]。但絕大部分miRNAs對(duì)破骨細(xì)胞分化與活化的調(diào)控機(jī)制仍亟待確定。

miR-185-3p是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的miRNA，已有報(bào)道多集中于miR-185-3p影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移等行為[6-7]。此外，miR-185-3p亦可參與細(xì)胞自噬的調(diào)控[8]。但尚無(wú)miR-185-3p調(diào)控破骨細(xì)胞分化與活化的相關(guān)報(bào)道。

筆者通過(guò)生物信息學(xué)方法，對(duì)mmu-miR-185-3p潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，取miRWalk，miRanda，RNA22，Targetscan四個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果交集，發(fā)現(xiàn)TRAF3為mmu-miR-185-3p的潛在靶基因之一。報(bào)道表明，TRAF 3能夠阻抑RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化形成過(guò)程[9]。RANKL通過(guò)TRAF 2/cIAP 1/2誘導(dǎo)TRAF 3發(fā)生泛素化和溶酶體降解，釋放NIK以磷酸化激活I(lǐng)KK-α，引起蛋白酶體將p100加工成為p52。RelB：p52異二聚體進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)相關(guān)靶基因表達(dá)。TNF不降解TRAF 3，從而導(dǎo)致NIK被降解，導(dǎo)致破骨細(xì)胞前體細(xì)胞質(zhì)中p100的積累，從而限制破骨細(xì)胞前體的分化[10]。

本文發(fā)現(xiàn)，miR-185-3p 可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，推測(cè)其可能通過(guò)靶向調(diào)控破骨細(xì)胞前體的TRAF3基因(破骨細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控基因)，進(jìn)而影響該細(xì)胞的形成，詳細(xì)機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。