徐 健,盧學(xué)春,段懿涵,王 珊,盛 瑜,徐廣宇,安麗萍,杜培革,孫晶波,*

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林吉林 132013;2.解放軍總醫(yī)院南樓血液科,北京 100853)

糖尿病是一種常見的代謝紊亂性疾病[1],主要與遺傳、年齡、收入、社會地位和受教育程度等因素相關(guān)[2]。該病以慢性高血糖為主要特征,常伴有“三多一少”癥狀,長期處于病理狀態(tài)可引發(fā)腎、肝等多器官疾病,進(jìn)而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。良好的血糖控制可降低與糖尿病相關(guān)慢性病的風(fēng)險及并發(fā)癥[3]。因此,如何預(yù)防及治療糖尿病已成為重要的全球議題。鏈尿佐菌素(STZ)是由產(chǎn)色鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素,常作為糖尿病模型誘導(dǎo)劑,選擇性破壞胰腺β細(xì)胞,使細(xì)胞活性降低,導(dǎo)致胰島素對組織攝取葡萄糖和高血糖的敏感性較差[4],還能夠影響肝細(xì)胞和腎小管細(xì)胞的表達(dá),這也是STZ對肝臟和腎臟產(chǎn)生毒性的原因之一[5]。

北冬蟲夏草(Cordycepsmilitaris),別名蛹蟲草、北蟲草,隸屬于子囊菌亞門,麥角菌科,蟲草屬[6],性平,味甘,入肺腎二經(jīng),既補(bǔ)肺陰,又補(bǔ)腎陽,是長白山地區(qū)資源豐富且藥食同源的道地藥材,其主要活性成分有腺苷、多糖、蟲草酸、蟲草素以及氨基酸等[7]。其中的多糖類成分具有多種生物活性。Liu等[8]研究表明,北冬蟲夏草多糖具有激活免疫細(xì)胞、改善和修復(fù)受損胰島細(xì)胞的降糖功效,并能顯著改善糖尿病小鼠體重及其臟器指數(shù)。黃芪、枸杞、西洋參也有不同程度的降糖和提高免疫力的作用[9-11],但以北冬蟲夏草為主藥協(xié)同其他藥材發(fā)揮降糖效果鮮有研究。因此,本試驗即通過觀察復(fù)方北冬蟲夏草提取物對STZ誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠的血糖相關(guān)指標(biāo)以及氧化應(yīng)激和脂代謝的影響,探究其降糖功效,為藥食同源類中藥品種在中藥降糖藥物或保健品的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北冬蟲夏草 鐵嶺市云欣蟲草生物有限公司開原分公司;黃芪、枸杞子、西洋參 威海松嶺諾可佳中藥飲片股份有限公司;Amberlite-XAD-2大孔樹脂 鄭州艾諾化工科技有限公司;葡萄糖、人參皂苷 中國藥品生物制品鑒定所;乙醇等化學(xué)試劑 均為分析純,沈陽華東試劑廠;Wistar雄性大鼠 長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號碼:SCXK(吉)-2016-0003;鏈脲佐菌素 Sigma公司;甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒、超氧化物歧化酶測試盒、丙二醛測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒、胰島素測試盒 南京建成生物工程研究所。

DHG-9070A真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV2600紫外分光光度計 島津;R5005KB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;TD-3213血糖儀 Roche Diagnostics Gmbh。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)方北冬蟲夏草提取物的制備 北冬蟲夏草22.5 g、黃芪40 g、枸杞30 g、西洋參25 g→雙餾水浸泡1.5 h→恒溫水浴回流提取→濾液→濃縮→真空干燥至恒重→復(fù)方北冬蟲夏草提取物。

操作要點:恒溫水浴回流提取后過濾,收集濾液,于70 ℃條件下濃縮至膏狀,于真空干燥箱中干燥至恒重,磨成粉末,計算提取率,密封備用。

提取率(%)=[干燥后所得粉末(g)/原料藥材總重量(g)]×100

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及總皂苷含量計算 總皂苷含量采用紫外分光光度法測定[12],以人參皂苷Re為標(biāo)品(2.000 mg/mL),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以1.2.1中提取物配制樣品并測定其吸光度值,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲得皂苷質(zhì)量,計算總皂苷含量。

總皂苷得率(%)=(樣品容積÷測定取樣量×總皂苷含量÷樣品的總質(zhì)量)×100

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及多糖含量計算 多糖含量采用“苯酚-硫酸分光光度測定法”測定[13],以葡萄糖為標(biāo)品(0.100 mg/mL),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,以1.2.1中提取物配制樣品并測定其吸光度值,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲得多糖質(zhì)量,計算多糖含量。

多糖得率(%)=[樣品容積÷測定取樣量×多糖含量÷樣品的總質(zhì)量]×100

1.2.4 單因素實驗 根據(jù)前期預(yù)實驗,提取率能夠間接反映提取物中多糖的含量,且測定簡單,故選擇提取率作為單因素實驗檢測指標(biāo)。

1.2.4.1 料液比對提取率的影響 按1.2.1中配比稱取樣品,固定反應(yīng)條件為提取時間1 h,提取次數(shù)1次,提取溫度70 ℃,考察不同料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL)對提取率的影響。

1.2.4.2 提取時間對提取率的影響 固定反應(yīng)條件料液比1∶8 g/mL,提取次數(shù)3次,提取溫度70 ℃,考察不同提取時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對提取率的影響。

1.2.4.3 提取次數(shù)對提取率的影響 固定反應(yīng)條件料液比1∶8 g/mL,提取時間1 h,提取溫度70 ℃,考察不同提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)對提取率的影響。

1.2.4.4 提取溫度對提取率的影響 固定反應(yīng)條件料液比1∶8 g/mL,提取時間1 h,提取次數(shù)1次,考察不同提取溫度(60、65、70、75、85 ℃)對提取率的影響。

1.2.5 正交試驗 根據(jù)預(yù)試驗及單因素實驗結(jié)果確定因素水平,詳見表1。以多糖含量和提取率為考察指標(biāo),采用L9(34)正交試驗優(yōu)化提取工藝。

表1 正交試驗的因素水平設(shè)計

1.2.6 STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型的建立 將飼養(yǎng)一周后的大鼠分出10只作為空白組,腹腔注射生理鹽水。其余大鼠分別單次腹腔注射STZ溶液(STZ溶于0.1 mol·L-1、pH=4.3的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液中)50 mg/kg,單次注射STZ前均斷糧不斷水12 h,7 d后檢測大鼠血糖值,以血糖值>15 mmol/mL為糖尿病模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.7 動物給藥和分組 取成模大鼠40只隨機(jī)平均分為模型組(生理鹽水)、低(250 mg/kg)、中(500 mg/kg)、高(1000 mg/kg)劑量組。空白組直接給予生理鹽水。各組給藥采取灌胃方式,每日一次,期間給予充足的水及飼料。給藥12周后,用10%的水合氯醛麻醉,觀察并記錄各組實驗大鼠的體重。

1.2.8 血糖值及血清胰島素含量檢測 麻醉后,腹主動脈取血,靜置后4 ℃離心(3000 r/min)10 min,取血清,按照試劑盒說明書測定大鼠空腹血糖值和胰島素含量。

1.2.9 大鼠肝組織中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力和腎臟甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量檢測 解剖實驗大鼠,取肝臟和腎臟,嚴(yán)格按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)檢測肝臟中MDA含量、SOD、GSH-PX活力及腎臟中TG、TC含量。

1.2.10 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察 新鮮腎臟組織于福爾馬林中固定24 h,經(jīng)程序脫水、石蠟包埋后,5 μm切片,用于組織HE染色檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方北冬蟲夏草提取物制備工藝優(yōu)化

2.1.1 人參總皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線 在560 nm波長下測定吸光度值,以人參皂苷Re質(zhì)量為橫坐標(biāo)(mg),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制人參總皂苷含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1),計算回歸方程Y=3.035X+0.1062,R2=0.9976,線性關(guān)系良好。

圖1 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 在490 nm波長下測定吸光度值,以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)(mg),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2),計算得回歸方程Y=4.0694X+0.0129,R2=0.99746,線性關(guān)系良好。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 單因素實驗 單因素實驗結(jié)果見圖3～圖6。結(jié)果表明,當(dāng)料液比偏小時(圖3),固/液兩相間有效成分的濃度差較小,溶液黏性較大,不利于有效成分的溶出。隨著料液比的增大,兩相濃度差增大,提取率增高,當(dāng)料液比達(dá)到1∶10 g/mL時,提取較為充分,而過大的料液比,不但造成了資源的浪費,對于提取效果也無明顯影響,因此選擇1∶8、1∶10、1∶12 g/mL三個因素進(jìn)行正交試驗。如圖4所示,提取率隨著時間的延長而升高,超過1.5 h后,提取率不再明顯增加,考慮獲得較高得率和工業(yè)生產(chǎn)能耗,選擇1、1.5、2 h三個水平進(jìn)行正交試驗。如圖5所示,當(dāng)提取次數(shù)為2次時,提取率明顯提高,且隨時間的增加,變化率不再明顯,考慮工業(yè)生產(chǎn)和材料成本,選擇1、2、3次三個水平進(jìn)行正交試驗。如圖6所示,隨著提取溫度的升高,提取率在75 ℃之后增加不再明顯,故選擇70、75、80 ℃三個水平進(jìn)行正交試驗。

圖3 料液比對提取率的影響

圖4 提取時間對提取率的影響

圖5 提取次數(shù)對提取率的影響

圖6 提取溫度對提取率的影響

2.1.4 正交試驗結(jié)果及極差分析 對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)合正交試驗結(jié)果及極差分析,由表2可知,各因素對復(fù)方北冬蟲夏草提取率的影響由大到小依次為提取次數(shù)>提取時間>料液比>提取溫度,最佳因素的水平組合為A3B2C3D2;各因素對于多糖提取的影響由大到小依次為料液比>提取溫度>提取時間>提取次數(shù),最佳因素的水平組合為A1B2C3D1,各因素對于總皂苷提取的影響由大到小依次為提取次數(shù)>提取溫度>提取時間>料液比,最佳因素的水平組合為A2B2C2D2和A2B2C3D2,三者搭配間唯有BC一致,根據(jù)直觀分析和經(jīng)濟(jì)效益以及單因素實驗結(jié)果等多方面考量,確定A2B2C3D1為最佳提取工藝參數(shù),即料液比為1∶10 g/mL,提取3次,每次提取1.5 h,提取溫度為70 ℃。經(jīng)三次平行試驗驗證平均提取率為53.1%,平均多糖得率為5.1 g/10 g,平均總皂苷得率為1.3 g/10 g,與正交試驗表中該組結(jié)果相近,證明該工藝重復(fù)性良好、穩(wěn)定。

表2 正交試驗結(jié)果及極差分析

2.2 糖尿病大鼠模型的建立

大鼠腹腔注射STZ溶液7 d后,檢測大鼠血糖值,94%的大鼠符合血糖值>15 mmol/mL,模型建立成功。

2.3 復(fù)方北冬蟲夏草對糖尿病大鼠體重的影響

由圖7結(jié)果提示,與空白組相比,模型組體重極顯著降低(P<0.01);與模型組比較,復(fù)方北冬蟲夏草提取物高劑量組體重顯著提高(P<0.05),低、中劑量組體重雖有上升趨勢,但不顯著(P>0.05),說明復(fù)方北冬蟲夏草提取物具有改善糖尿病大鼠質(zhì)量的作用。STZ誘導(dǎo)的糖尿病具有嚴(yán)重的體重減輕特征,這可能是因為肌肉和脂肪細(xì)胞組織退化以補(bǔ)償能量損失[14],糖尿病作為一種長期代謝紊亂的疾病,長期病理狀態(tài)下,高血糖及其并發(fā)癥嚴(yán)重影響糖尿病大鼠身體狀況及正常生活水平,因此復(fù)方北冬蟲夏草提取物能夠改善糖尿病大鼠的體重。

圖7 復(fù)方北冬蟲夏草提取物對大鼠體重的影響

2.4 復(fù)方北冬蟲夏草對大鼠血糖值及胰島素含量的影響

糖尿病是一種代謝性疾病,其特征是血液中葡萄糖水平升高以及體內(nèi)胰腺分泌的胰島素不足或功能性障礙[15],胰島素是胰腺β細(xì)胞中響應(yīng)各種刺激(例如葡萄糖、磺酰脲和精氨酸)而合成的一種蛋白質(zhì)[16],體內(nèi)胰島素分泌不足或?qū)σ葝u素的抵抗會降低組織對葡萄糖的攝取,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)低血糖和細(xì)胞外高血糖。細(xì)胞內(nèi)低血糖會導(dǎo)致糖原異生和糖異生,導(dǎo)致脂肪分解,形成糖尿病性酮癥酸中毒,而細(xì)胞外高血糖則導(dǎo)致高血糖昏迷和滲透性糖尿病[17],因此觀察血糖和胰島素的含量變化在糖尿病治療中至關(guān)重要。由表3可知,給藥治療12周后,與空白組相比,模型組大鼠血糖值極顯著升高(P<0.01),血清中胰島素含量極顯著降低(P<0.01),再次證明STZ誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠模型建立成功;與模型組相比,復(fù)方北冬蟲夏草提取物中劑量組大鼠血糖值顯著下降(P<0.05),高劑量組血糖值極顯著下降(P<0.01),中、高劑量組大鼠胰島素含量均顯著升高(P<0.05),而低劑量組血糖值有降低趨勢、血清中胰島素含量有升高趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說明復(fù)方北冬蟲夏草提取物具有改善糖尿病胰島機(jī)能的作用,這一作用效果與給藥劑量密切相關(guān)。

表3 各組大鼠血糖值及血清胰島素含量(n=10)

2.5 復(fù)方北冬蟲夏草對大鼠肝臟MDA含量、SOD及GSH-Px活力的影響

高血糖會通過葡萄糖自氧化作用增加ROS的產(chǎn)生,進(jìn)而增加脂質(zhì)氧化[18],而過量的ROS超出人體可清除的能力,會損壞細(xì)胞大分子,引起蛋白質(zhì)糖基化和氧化變性,對細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[19-20]。根據(jù)Antonio等[21]和Fukuda等[22]的研究,MDA是由于脂質(zhì)過氧化作用而形成的,脂質(zhì)過氧化作用可在脂質(zhì)過氧化物與硫代巴比妥酸反應(yīng)后用于測量脂質(zhì)過氧化物,MDA含量常?？梢苑从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。由圖8所示,與空白組相比,模型組大鼠肝臟MDA含量極顯著升高(P<0.01),與模型組相比,復(fù)方北冬蟲夏草低劑量組MDA含量顯著下降(P<0.05),中、高劑量組MDA含量極顯著下降(P<0.01),說明模型組脂質(zhì)過氧化作用過激,經(jīng)治療后得到改善。

圖8 復(fù)方北冬蟲夏草提取物對MDA含量的影響

谷胱甘肽和SOD是糖尿病中氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物,糖尿病引起谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性的改變,這些酶將過氧化物代謝為水,并將谷胱甘肽二硫化物轉(zhuǎn)化回谷胱甘肽[15],其水平的任何改變都將使細(xì)胞易于產(chǎn)生氧化應(yīng)激并因此損害細(xì)胞。SOD是體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的主要金屬酶,通過催化氧氣代謝中ROS超氧化物與分子氧和過氧化物的比例,將超氧化物分解為其他毒性較小的化合物[23-24],維持機(jī)體氧化平衡。由圖9、圖10所示,與空白組相比,模型組大鼠SOD和GSH-Px活力極顯著下降(P<0.01),說明隨著發(fā)病時間的推移,糖尿病大鼠氧化平衡破壞,氧化應(yīng)激嚴(yán)重紊亂,與模型組相比,復(fù)方北冬蟲夏草低、中劑量組SOD活力顯著增加(P<0.05),高劑量組SOD活力極顯著升高(P<0.01);而三個劑量組大鼠GSH-Px活力均顯著升高(P<0.05),這與梁勇剛[25]對穿心蓮內(nèi)酯注射液對1型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激的研究結(jié)果相一致,表明復(fù)方北冬蟲夏草提取物可提高糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激水平,具有明顯的抗氧化能力。

圖9 復(fù)方北冬蟲夏草提取物對SOD活力的影響

圖10 復(fù)方北冬蟲夏草提取物對GSH-Px活力的影響

2.6 復(fù)方北冬蟲夏草對大鼠腎臟TG、TC含量的影響

長期處于糖尿病狀態(tài)下,可導(dǎo)致調(diào)節(jié)脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶表達(dá)下降,進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體脂代謝異常[26]。根據(jù)夏惠[27]的研究,TG、TC作為脂代謝的重要指標(biāo),其含量的增加是導(dǎo)致脂代謝紊亂的原因之一,也是糖尿病大鼠腎功能惡化的重要因素。由圖11、圖12可知,與空白組相比,模型組糖尿病大鼠腎臟中TG和TC含量均極顯著提高(P<0.01),表明模型組大鼠脂代謝異常;與模型組相比,復(fù)方北冬蟲夏草低、中劑量組TG、TC含量顯著下降(P<0.05),高劑量組TG、TC含量極顯著下降(P<0.01),說明經(jīng)給藥經(jīng)治療后,大鼠脂代謝有所改善,且呈劑量依賴性增強(qiáng)。

圖11 復(fù)方北冬蟲夏草提取物對TG含量的影響

圖12 復(fù)方北冬蟲夏草提取物對TC含量的影響

2.7 復(fù)方北冬蟲夏草對大鼠腎臟組織形態(tài)的影響

由圖13可見,空白組大鼠腎臟包膜完整,腎小球結(jié)構(gòu)清晰完整,且未見結(jié)構(gòu)或大或小變化,腎小管上皮細(xì)胞無變性跡象,管腔內(nèi)無滲出物;而模型組大鼠腎臟出現(xiàn)腎小球體積增大,形狀不規(guī)則,腎小球毛細(xì)血管袢及腎小管基底膜增厚,系膜細(xì)胞增殖,腎小球系膜基質(zhì)增生,腎小體減少,這與杜時晶[28]對于1型糖尿病大鼠腎臟的病理形態(tài)描述相符;低劑量組腎小球形狀規(guī)則,結(jié)構(gòu)較為清晰,中劑量組腎小體增多,高劑量組腎小球雖形態(tài)偏大,但形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整,腎小管基底膜基本恢復(fù),腎小體增多。表明復(fù)方北冬蟲夏草提取物可改善糖尿病大鼠的腎損傷。

圖13 大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)比較(HE×400)

3 結(jié)論

本研究采用水煎煮法提取復(fù)方北冬蟲夏草,通過單因素試驗和正交試驗篩選并優(yōu)化復(fù)方北冬蟲夏草的最佳提取工藝:料液比1∶10 g/mL,提取3次,每次1.5 h,提取溫度為70 ℃,此工藝條件下的平均提取率為53.1%,平均多糖得率為5.1%,平均總皂苷得率為1.3%。大鼠經(jīng)STZ誘導(dǎo)給藥后,與空白組比較,大鼠體重極顯著下降(P<0.01),糖尿病典型特征血糖水平極顯著升高(P<0.01),且胰島素含量極顯著降低(P<0.01),說明1型糖尿病模型建立成功;與模型組相比,復(fù)方北冬蟲夏草提取物高劑量組糖尿病大鼠的體重、胰島素水平和GSH-Px活力均顯著提高(P<0.05),SOD活力極顯著提高(P<0.01),而血糖值、肝臟MDA及腎臟TG、TC水平則極顯著降低(P<0.01),并從組織學(xué)上證明復(fù)方北冬蟲夏草提取物可有效改善糖尿病大鼠的腎損傷程度。

綜上所述,復(fù)方北冬蟲夏草提取物對糖尿病大鼠具有良好的降血糖作用,其降糖機(jī)制可能與改善機(jī)體氧化應(yīng)激水平和影響脂代謝途徑相關(guān),其具體信號通路需要進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果將為開發(fā)北冬蟲夏草系列產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。