陳 燁 ，段真珍 ，楊冬梨 ，李 琳 ，2，3，4，李玉紅 ，2，3，4

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；3.天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；4.方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

缺血性心臟病（IHD）嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。雖然發(fā)達(dá)國(guó)家IHD發(fā)病率有所降低，但仍占35歲以上人群病死率的1/3[1]。目前臨床采用經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（PCI）、冠脈搭橋術(shù)等治療手段，通過(guò)恢復(fù)血流供應(yīng)達(dá)到緩解心臟缺血缺氧損傷的目的。然而隨著血流的恢復(fù)，心功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷有時(shí)反而進(jìn)一步加重，出現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷（MIRI）。MIRI嚴(yán)重影響IHD患者預(yù)后，因而成為治療IHD的瓶頸之一。線(xiàn)粒體是細(xì)胞能量代謝中心，通過(guò)呼吸鏈的電子傳遞偶聯(lián)磷酸化產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP），以提供細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量。研究發(fā)現(xiàn)MIRI通過(guò)多種途徑介導(dǎo)線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）持續(xù)開(kāi)放，并進(jìn)一步導(dǎo)致線(xiàn)粒體內(nèi)膜通透性增加，呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯(lián)，從而削弱線(xiàn)粒體能量代謝功能，加速心肌細(xì)胞損傷[2]。挽救激酶信號(hào)通路磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶（MEK）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2能夠抑制線(xiàn)粒體和心肌細(xì)胞損傷，在MIRI中發(fā)揮重要作用[3]。

丹紅注射液（DHI）由丹參和紅花組成，臨床上廣泛用于治療心腦血管疾病。丹參酮、丹酚酸、丹參酚酸、紅花黃素為DHI主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等藥理作用。臨床研究表明，DHI能有效減輕心肌梗死引起的心臟損傷[4]。課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，DHI通過(guò)抑制mPTP開(kāi)放保護(hù)缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷的心肌細(xì)胞。王佩等[6]研究發(fā)現(xiàn)DHI激活PI3K/Akt信號(hào)通路減輕大鼠MIRI。然而DHI對(duì)MIRI線(xiàn)粒體氧化磷酸化功能及PI3K/Akt等挽救激酶信號(hào)通路調(diào)節(jié)的線(xiàn)粒體損傷機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬采用體外H/R損傷的心肌細(xì)胞模型，從線(xiàn)粒體能量代謝、PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號(hào)通路，研究丹紅注射液對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 新生1～3 d SD乳鼠，雌雄不分。購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 主要試劑 四甲基噻唑藍(lán)（MTT）、PD98059、羅丹明123（Rh123）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，DMEM無(wú)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，RIPA 裂解液、5×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液、BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；β-actin、磷酸化ERK（p-ERK）1/2Thr202/Tyr204、ERK1/2、磷酸化 Akt（p-Akt）Ser473、Akt抗體購(gòu)于美國(guó) CST 公司；LY294002購(gòu)于美國(guó)Apollo Scientific公司；XF分析培養(yǎng)基、探針?biāo)?、線(xiàn)粒體應(yīng)激檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Seahorse Bioscience公司。

2 方法

2.1 原代心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定 出生后1～3 d的乳鼠，75%乙醇浸泡消毒，眼科剪沿左側(cè)肋骨快速打開(kāi)乳鼠胸腔摘取心臟，洗滌后剪碎。加入0.1%Ⅱ型膠原酶和0.06%的胰蛋白酶溶液多次消化。200目篩過(guò)濾消化液去除未消化組織塊，離心過(guò)濾液，棄上清收集細(xì)胞。細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱差速貼壁1.5 h，收集未貼壁的細(xì)胞懸液，重新接種于新的培養(yǎng)瓶中，并于前3 d加用0.1 mmol/L溴脫氧尿苷抑制非心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。培養(yǎng)2～3 d，待貼壁的心肌細(xì)胞連成片狀，觀察細(xì)胞形態(tài)及搏動(dòng)情況。

2.2 H/R模型的建立 參照文獻(xiàn)[7]建立細(xì)胞糖氧剝奪的H/R模型。缺氧處理開(kāi)始前，將DMEM高糖培養(yǎng)基換為DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基，37℃密閉的缺氧小室中缺氧處理9 h。缺氧處理結(jié)束后，更換為DMEM高糖培養(yǎng)基，正常CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧培養(yǎng)2 h。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為正常組、損傷組、DHI干預(yù)損傷組、DHI和抑制劑干預(yù)損傷組、抑制劑干預(yù)損傷組。正常組細(xì)胞行正常培養(yǎng)，損傷組僅進(jìn)行H/R損傷處理，DHI干預(yù)損傷組細(xì)胞缺氧前，用含DHI（10 μL/mL）的DMEM高糖培養(yǎng)基預(yù)孵育10 h，且H/R過(guò)程中培養(yǎng)液中添加DHI（10 μL/mL）。DHI和抑制劑干預(yù)損傷組缺氧前，用含DHI（10 μL/mL）和抑制劑（15 μmol/L 的 LY294002或 20 μmol/L 的PD98059）的DMEM高糖培養(yǎng)基預(yù)孵育細(xì)胞10 h，H/R過(guò)程培養(yǎng)液中均添加上述濃度DHI和抑制劑。抑制劑干預(yù)損傷組細(xì)胞H/R前，用含抑制劑的DMEM高糖培養(yǎng)基預(yù)處理10 h，H/R時(shí)培養(yǎng)液中添加抑制劑。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束后，棄孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基和20 μL 的 MTT（5 g/L）。孵育 4 h 后，吸棄孔內(nèi)液體，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL/孔，酶標(biāo)儀讀取570 nm波長(zhǎng)下的A值，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.5 線(xiàn)粒體膜電位的測(cè)定 細(xì)胞經(jīng)處理后，每孔加入100 μL Rh123工作液，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min。熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)A值（499 nm/535 nm）。

2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)心肌細(xì)胞蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束后，提取細(xì)胞總蛋白。利用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，定量蛋白總量。行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h，4℃孵育Akt、p-Akt Ser473、ERK、p-ERK Thr202/Tyr204、β-actin 抗體過(guò)夜。TBST洗去一抗，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，化學(xué)發(fā)光并顯影、定影。

2.7 線(xiàn)粒體呼吸的測(cè)定 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)2～3 d后，收集細(xì)胞并以1×106個(gè)/mL接種于XF24細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育5 h后，加入150 μL完全培養(yǎng)基孵育過(guò)夜。心肌細(xì)胞用含DHI終濃度為1、10 μL/mL的DMEM/F12基礎(chǔ)培基預(yù)孵育6 h，直接進(jìn)行生物能量檢測(cè)。H/R處理組缺氧5 h/復(fù)氧1 h，并同時(shí)給予DHI孵育，再進(jìn)行線(xiàn)粒體生物能量檢測(cè)。通過(guò)加入不同的呼吸鏈復(fù)合物抑制劑寡霉素（1 μmol/L）、線(xiàn)粒體氧化磷酸化抑制劑（FCCP）（1.5 μmol/L）、抗霉素（1 μmol/L）、魚(yú)藤酮（1 μmol/L），檢測(cè)基礎(chǔ)耗氧率、最大耗氧率、非線(xiàn)粒體呼吸，并通過(guò)計(jì)算得出ATP相關(guān)的耗氧量、質(zhì)子漏及儲(chǔ)備能力。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 原代心肌細(xì)胞的鑒定 倒置顯微鏡觀察，對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行鑒定。接種6 h心肌細(xì)胞逐漸開(kāi)始貼壁，呈扁圓形或梭形，無(wú)搏動(dòng)。接種24 h后細(xì)胞進(jìn)一步伸展，出現(xiàn)分叉狀偽足，并開(kāi)始搏動(dòng)。培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞完全貼壁且呈規(guī)律性的同步搏動(dòng)，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、不規(guī)則三角形或多邊形，胞漿突起呈偽足狀，且偽足相互連接成片狀生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

圖1 原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞48 h后生長(zhǎng)狀態(tài)（200×）

3.2 DHI對(duì)H/R損傷后心肌細(xì)胞Akt的影響 由圖2可見(jiàn)，與正常組相比，H/R使心肌細(xì)胞存活率、Δφm水平顯著下降（P＜0.01）。與損傷組相比，DHI給藥后細(xì)胞存活率、Δφm、Akt蛋白磷酸化水平顯著增加（P＜0.05或 P＜0.01）。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用 PI3K 抑制劑LY294002進(jìn)行干預(yù)，與損傷組相比，單獨(dú)給予LY294002后，心肌細(xì)胞存活率和Δφm沒(méi)有顯著改變。與DHI干預(yù)損傷組相比，LY294002和DHI共同干預(yù)后，DHI對(duì)H/R損傷的心肌細(xì)胞保護(hù)作用被顯著抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率、Δφm和PI3K下游的Akt蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2 DHI對(duì)H/R損傷后心肌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

3.3 DHI對(duì)H/R損傷后心肌細(xì)胞ERK1/2的影響 與正常組相比，H/R損傷后心肌細(xì)胞存活率顯著降低，DHI可顯著升高心肌細(xì)胞存活率，增加心肌細(xì)胞內(nèi)ERK1/2蛋白Thr202/Tyr204位磷酸化水平（P＜0.05或 P＜0.01）。MEK 的抑制劑 PD98059能夠顯著抑制DHI的心肌保護(hù)作用，使細(xì)胞存活率明顯降低，且抑制DHI對(duì)MEK下游ERK1/2的促磷酸化作用，使ERK1/2Thr202/Tyr204的磷酸化水平顯著下降（P＜0.05或 P＜0.01）。見(jiàn)圖 3。

圖3 DHI對(duì)H/R損傷后心肌細(xì)胞ERK1/2信號(hào)通路的影響

3.4 DHI對(duì)常氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體能量代謝的影響 與正常組相比，DHI預(yù)給藥（10 μL/mL）能顯著增加質(zhì)子漏耗氧率（P＜0.05），但對(duì)基礎(chǔ)耗氧率、最大耗氧率、ATP相關(guān)耗氧率、非線(xiàn)粒體呼吸耗氧率及儲(chǔ)備能力均無(wú)影響。見(jiàn)圖4。

3.5 DHI對(duì)H/R損傷的心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體能量代謝的影響 DHI能夠增加H/R損傷的心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體基礎(chǔ)耗氧率、最大耗氧率、儲(chǔ)備能力和非線(xiàn)粒體呼吸耗氧率，其中10 μL/mL的DHI干預(yù)損傷組更優(yōu)（P＜0.05或 P＜0.01）。見(jiàn)圖 5。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞H/R損傷模型，研究DHI通過(guò)激活A(yù)kt和ERK1/2，減輕H/R損傷，改善線(xiàn)粒體能量代謝的作用。

圖4 DHI對(duì)常氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體能量代謝的影響

圖5 DHI對(duì)H/R損傷的心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體能量代謝的影響

再灌注損傷挽救激酶信號(hào)通路主要包括PI3K/Akt和MEK/ERK1/2通路。PI3K/Akt通路與細(xì)胞生命活動(dòng)息息相關(guān)，參與蛋白質(zhì)合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和血管生成等重要生理功能的調(diào)控，并介導(dǎo)外界刺激信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、蛋白翻譯、代謝、凋亡等過(guò)程[8]。ERK1/2是MAPK家族的成員之一，該家族主要參與細(xì)胞增殖分化和生存，該信號(hào)級(jí)聯(lián)在再灌注早期被活化。MEK是ERK1/2的上游激活蛋白。心肌再灌注期RISK途徑中Akt和ERK1/2成為介導(dǎo)心肌保護(hù)信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，Juhaszova等[9]研究表明，各類(lèi)不同的心肌保護(hù)劑都能激活PI3KAkt和MEK1/2-ERK1/2通路磷酸化，抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），抑制 mPTP 開(kāi)放，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT檢測(cè)心肌細(xì)胞活力，應(yīng)用熒光分子探針Rh123檢測(cè)心肌細(xì)胞Δφm，證明DHI可顯著增加H/R后細(xì)胞活力和Δφm，減輕H/R引起的細(xì)胞損傷。應(yīng)用PI3K通路抑制劑LY294002和MEK抑制劑PD98059干預(yù)后，抑制了DHI減輕細(xì)胞損傷的作用，Western blot蛋白檢測(cè)結(jié)果也顯示，DHI能增加PI3K和MEK下游的Akt、ERK蛋白磷酸化水平，DHI可能通過(guò)激活PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，與文獻(xiàn)研究相吻合[10]。

造成心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制有活性氧的損傷、鈣離子超載、白細(xì)胞損傷及高能磷酸化合物生成障礙，線(xiàn)粒體受損及引起的能量代謝障礙在MIRI中扮演著重要角色。線(xiàn)粒體作為細(xì)胞呼吸和氧化磷酸化的場(chǎng)所，約80%～90%的ATP是由位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈及ATP合酶加工而成的，心肌缺血缺氧嚴(yán)重影響了線(xiàn)粒體呼吸功能[11]，反之線(xiàn)粒體功能障礙，包括能量產(chǎn)生障礙、活性氧的產(chǎn)生、鈣離子超載以及線(xiàn)粒體通路誘導(dǎo)的凋亡等，又進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞損傷[12]。線(xiàn)粒體在正常條件下，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本生命活動(dòng)，在應(yīng)激條件下，介導(dǎo)細(xì)胞的分化、凋亡等過(guò)程。線(xiàn)粒體的能量代謝狀態(tài)是線(xiàn)粒體功能最顯著的表現(xiàn)。質(zhì)子漏是電子傳遞鏈跨膜泵出的質(zhì)子通過(guò)不涉及ATP合成的途徑而跨膜擴(kuò)散流回基質(zhì)的過(guò)程，形成了由呼吸鏈驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子泵出和質(zhì)子回漏的無(wú)效循環(huán)通路，質(zhì)子漏在基礎(chǔ)代謝中的作用有：產(chǎn)熱以維持體溫、提高調(diào)節(jié)代謝的潛能、減少有害自由基的產(chǎn)生和碳流的調(diào)節(jié)[13]。本研究運(yùn)用海馬生物能量檢測(cè)儀，分別檢測(cè)了常氧和H/R狀態(tài)下DHI對(duì)心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體呼吸的影響，發(fā)現(xiàn)DHI能夠升高常氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體質(zhì)子漏耗氧率，進(jìn)一步的機(jī)制或作用尚需要深入研究。線(xiàn)粒體呼吸儲(chǔ)備能力的大小與細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下自身的調(diào)節(jié)適應(yīng)能力相關(guān)，細(xì)胞儲(chǔ)備能力越大，則其對(duì)抗應(yīng)激狀態(tài)、維持細(xì)胞正常功能的能力越強(qiáng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，DHI（10 μL/mL）預(yù)給藥可通過(guò)增加 H/R損傷的心肌細(xì)胞基礎(chǔ)耗氧率及最大耗氧率，增加線(xiàn)粒體儲(chǔ)備能力，從而增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗應(yīng)激能力，發(fā)揮抗H/R損傷的作用。此外，DHI（10 μL/mL）還可增加H/R后心肌細(xì)胞的非線(xiàn)粒體呼吸耗氧率。以線(xiàn)粒體的儲(chǔ)備能力增加最為顯著，表明了DHI對(duì)H/R條件下心肌細(xì)胞能量代謝的改變情況。也可能與DHI抑制了H/R引起的細(xì)胞活力降低相關(guān)，即增加了細(xì)胞活力，降低了細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體基礎(chǔ)耗氧率、最大耗氧率等能量代謝的增強(qiáng)，如果能提取單個(gè)細(xì)胞或?qū)罴?xì)胞進(jìn)行定量，然后分析其呼吸功能，更能直接體現(xiàn)藥物對(duì)線(xiàn)粒體呼吸功能的影響。

此外，線(xiàn)粒體既是ATP的生成中心，為生命活動(dòng)提供能量，同時(shí)也是活性氧產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，過(guò)多的活性氧對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，有學(xué)者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，藥物通過(guò)抑制線(xiàn)粒體氧化磷酸化可以保護(hù)細(xì)胞，人參的有效成分人參皂苷Rb1、Rg1，尤其是人參皂苷Rc能夠抑制大腦皮層和海馬突觸體的線(xiàn)粒體呼吸、氧化磷酸化，改變能量代謝，保護(hù)對(duì)氧化應(yīng)激敏感的中樞神經(jīng)細(xì)胞[15]。

綜上所述，DHI能夠激活心肌細(xì)胞PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號(hào)通路的Akt和ERK1/2，發(fā)揮抗H/R損傷的作用，通過(guò)改善H/R后線(xiàn)粒體能量代謝狀態(tài)，增加心肌細(xì)胞儲(chǔ)備能力。DHI對(duì)Akt和ERK1/2上游蛋白的調(diào)節(jié)作用有待進(jìn)一步研究。