復(fù)方苦參灌腸劑急性毒性及直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn)研究*

朱 鳳，楚 思，吳 慧，劉與進(jìn)，范 恒

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430022）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因未明的結(jié)腸和直腸的慢性非特異性炎癥性疾病，病變局限于大腸黏膜及黏膜下層，臨床以腹痛及排便異常為特征[1-2]，本病纏綿難愈，嚴(yán)重影響患者身心健康[3]，其西藥治療效果有限，且長(zhǎng)期治療多伴有嚴(yán)重不良反應(yīng)。復(fù)方苦參灌腸劑是由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科研制的能有效治療潰瘍性結(jié)腸炎的驗(yàn)方，此中藥復(fù)方具有清熱燥濕、生肌止血、涼血解毒功效，中藥結(jié)合西藥治療潰瘍性結(jié)腸炎，其臨床效果明顯優(yōu)于單純西藥治療[4-5]，且顯著提高患者生活質(zhì)量。雖然多數(shù)中藥、天然藥物作用相對(duì)溫和，毒性輕，但是近年來(lái)隨著對(duì)中藥及其制劑的廣泛應(yīng)用和對(duì)毒性研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)一些補(bǔ)益的中藥和許多普遍認(rèn)為“無(wú)毒”的中藥也存在一定的毒副作用[6]。本研究依據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究指導(dǎo)原則》的要求[7]，探討了復(fù)方苦參灌腸劑灌腸給藥對(duì)小鼠的急性毒性以及對(duì)大鼠多次直腸給藥后的刺激反應(yīng)，結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)藥物

1.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 復(fù)方苦參灌腸劑濃縮液：由湖北省中醫(yī)院藥劑科提供，批號(hào)：20181022。復(fù)方苦參灌腸劑：苦參600 g，地榆炭600 g，白及400 g，青黛200 g，甘草 300 g，三七粉 100 g，仙鶴草 300 g，薏苡仁 600 g，黃柏 400 g，黃連 400 g，秦皮 400 g，白頭翁300 g，煎煮2次，濃縮至3 290 mL，無(wú)菌分裝14瓶，藥物濃度約為1.40 g/mL，成人每日用量為230 g生藥/60 kg，其中隨機(jī)選取1瓶用生理鹽水稀釋兩倍，濃度為0.7 g/mL。

1.2 直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn) 復(fù)方苦參灌腸劑由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科提供，批號(hào)：20181022。苦參 30 g，地榆炭 30 g，白及 20 g，青黛 10 g，甘草 15 g，三七 5 g，仙鶴草 15 g，薏苡仁30 g，黃柏 20 g，黃連 20 g，秦皮 20 g，白頭翁 15 g，濃縮至150 mL，每日劑量為230 g生藥/60 kg。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) SPF級(jí)昆明小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)為SCXK（鄂）2016-0009。飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫：（22±3）℃，相對(duì)濕度：55%～60%，無(wú)對(duì)流風(fēng)，人工晝夜（12 h白晝、12 h黑夜）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2.2 直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn) SPF級(jí)SD大鼠20只，體質(zhì)量150～200 g，雌雄各半，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)為SCXK（鄂）2016-0009。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 因復(fù)方苦參灌腸劑毒性低，動(dòng)物灌腸給藥受藥物濃度和體積限制，測(cè)不出半數(shù)致死量（LD50），故進(jìn)行最大給藥量實(shí)驗(yàn)。取4～5周18～22 g SPF級(jí)昆明小鼠40只，其中雌雄小鼠均各隨機(jī)分為2組，每組10只，將4組小鼠不同性別之間隨機(jī)匹配分為2組，每組20只，雌雄各半，分為正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。正常對(duì)照組予以生理鹽水灌腸，實(shí)驗(yàn)組予以0.7 g/mL復(fù)方苦參灌腸劑灌腸，灌腸體積為0.04 mL/g。

3.2 直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn) 依據(jù)參考文獻(xiàn)[8]，SPF級(jí)SD大鼠20只，其中雌雄大鼠均各隨機(jī)分為2組，每組5只，將4組小鼠不同性別之間隨機(jī)匹配分為2組，每組10只，雌雄各半，分為正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組以臨床用藥量、臨床給藥途徑相同的方式，按體表面積等效劑量換算成給藥劑量，大鼠每日給藥11.0 g生藥/kg（大鼠）。正常對(duì)照組予以等量生理鹽水灌腸。給藥前予以10%水合氯醛將大鼠麻醉，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水4 h，給藥后2 h結(jié)束禁食，每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

4 觀察指標(biāo)

4.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 給藥前動(dòng)物禁食不禁水12 h，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天24 h內(nèi)分別灌腸給予濃度為0.7 g/mL的復(fù)方苦參灌腸劑和生理鹽水，按0.04 mL/g體積灌腸兩次，灌腸前進(jìn)行麻醉處理，灌腸完成后用棉花為小鼠保暖。觀察并記錄給藥后30 min、2 h及隨后14 d小鼠外觀、行為、飲食、排泄物及毒性反應(yīng)，每日稱體質(zhì)量；記錄14 d內(nèi)死亡小鼠數(shù)，死亡小鼠立即解剖，觀察其內(nèi)臟病理變化，若有肉眼可觀察到的異常變化則進(jìn)行病理檢查。所有小鼠實(shí)驗(yàn)第15天脫頸處死，解剖觀察心、肝、脾、肺、腎、結(jié)腸病理變化，每組各取雌雄1只，內(nèi)臟組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色后，光鏡下觀察藥物對(duì)各臟器的影響。

4.2 直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn) 每日觀察大鼠毒性反應(yīng)情況，詳細(xì)記錄癥狀出現(xiàn)、加重、減輕或死亡的時(shí)間和出現(xiàn)反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)量，計(jì)算動(dòng)物病死率。給藥后24 h時(shí)每組處死1只大鼠，解剖觀察直腸黏膜充血、水腫情況，按照表1評(píng)分判斷刺激性，并行病理學(xué)檢查。第8天每組解剖5只動(dòng)物，剩余4只動(dòng)物停藥繼續(xù)觀察1周。同樣肉眼觀察解剖動(dòng)物直腸黏膜有無(wú)充血、紅腫等現(xiàn)象。按照表1以積分評(píng)價(jià)方法判斷藥物對(duì)直腸黏膜是否有刺激性，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。如果病理檢查結(jié)果有異常，則停藥觀察的大鼠需做組織病理學(xué)檢查；如果檢查結(jié)果無(wú)異常，則停藥觀察的動(dòng)物只需行解剖肉眼觀察。

表1 局部黏膜刺激及反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6.1.1 各組小鼠病死率及一般情況變化 14 d內(nèi)各組小鼠病死率及臨床變化如下：實(shí)驗(yàn)組及正常對(duì)照組小鼠在兩次灌腸30 min內(nèi)，由于處于麻醉狀態(tài)出現(xiàn)倦怠懶動(dòng)、飲食減少，毛發(fā)、排泄物均正常，2 h后恢復(fù)反應(yīng)靈敏，活動(dòng)自如，飲食正常，口鼻無(wú)異常分泌物，連續(xù)觀察14 d，動(dòng)物一般情況良好，活動(dòng)自如，皮毛光滑，飲食及二便未見(jiàn)明顯異常；無(wú)死亡小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死所有小鼠，解剖肉眼觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎、結(jié)腸等主要臟器未見(jiàn)明顯異常。見(jiàn)表2。

6.1.2 各組小鼠體質(zhì)量變化 灌腸給藥復(fù)方苦參灌腸劑后，連續(xù)觀察14 d小鼠體質(zhì)量變化情況。實(shí)驗(yàn)表明，給藥后，兩組小鼠在給藥后體質(zhì)量均較前增加，給藥后實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量增長(zhǎng)與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表2 復(fù)方苦參灌腸劑急性毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠死亡情況的影響

6.1.3 各組小鼠內(nèi)臟組織病理學(xué)變化 兩組小鼠心、肝、脾、肺、腎及結(jié)腸組織標(biāo)本HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的心、肝、脾、肺、腎及結(jié)腸組織均無(wú)明顯病理改變。各組心臟組織心肌細(xì)胞排列有序，細(xì)胞著色未見(jiàn)異常，肝組織細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞形態(tài)良好，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰，間隔正常，管壁結(jié)構(gòu)良好；脾組織淋巴細(xì)胞排列緊密，無(wú)淤血和點(diǎn)狀壞死；腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球正常；腸黏膜完整，黏膜下層腺體排列完好，可散見(jiàn)杯狀細(xì)胞，各組各個(gè)臟器無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸出、纖維化和壞死等病理變化。

6.2 直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6.2.1 大鼠臨床表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)組及正常對(duì)照組大鼠每日給藥后30 min內(nèi)均出現(xiàn)倦怠懶動(dòng)，考慮與麻藥作用有關(guān)，毛發(fā)色澤及排泄物均正常，2 h后恢復(fù)正?；顒?dòng)狀態(tài)。直至觀察期結(jié)束，大鼠死亡情況見(jiàn)表4，實(shí)驗(yàn)大鼠均未出現(xiàn)毒性反應(yīng)。見(jiàn)表4。

6.2.2 大鼠體質(zhì)量變化情況 兩組大鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，且兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表5。

6.2.3 大鼠解剖觀察結(jié)果 給藥24 h時(shí)各組解剖1只大鼠觀察直腸黏膜，兩組均無(wú)充血、水腫現(xiàn)象，灌腸部位黏膜完整，無(wú)異常分泌物，血管走形清晰。連續(xù)給藥7 d后每組解剖5只大鼠觀察直腸黏膜，兩組直腸黏膜結(jié)構(gòu)正常，黏膜完整，無(wú)異常分泌物、局部硬結(jié)及充血水腫等。兩組剩余4只動(dòng)物停藥繼續(xù)觀察1周，均未見(jiàn)明顯異常。評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表6及表7。

6.2.4 大鼠腸道組織病理學(xué)檢查結(jié)果 正常對(duì)照組：腸黏膜完整，無(wú)潰瘍，黏膜腺體間無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，淺表無(wú)糜爛及不典型增生，可見(jiàn)散在杯狀細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組：腸壁黏膜全層關(guān)系清晰，結(jié)構(gòu)無(wú)改變，無(wú)糜爛、潰瘍，黏膜腺體間無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)杯狀細(xì)胞。兩組直腸病理檢查結(jié)果均正常。見(jiàn)圖2。

7 討論

急性毒性實(shí)驗(yàn)是一次性給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某種受試物后，觀察在短時(shí)間內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法[9-10]。復(fù)方苦參灌腸劑臨床給藥成人每日劑量為230 g/60 kg，小鼠灌腸一次性最大給藥量為1 680 g/60 kg，應(yīng)用復(fù)方苦參灌腸劑對(duì)小鼠進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，以可灌腸最高濃度0.7 g/mL，24 h內(nèi)灌腸給藥兩次（相當(dāng)于成人臨床每日等效用量的14.6倍）。連續(xù)觀察14 d，未見(jiàn)動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)，體質(zhì)量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，病理組織檢查未見(jiàn)明顯變化，因此本品小鼠灌腸最大耐受劑量＞1680g/60kg。在本次實(shí)驗(yàn)條件下，復(fù)方苦參灌腸劑多次直腸給藥對(duì)大鼠直腸黏膜無(wú)刺激性，且對(duì)大鼠體質(zhì)量及直腸病理檢查無(wú)明顯改變。

表3 復(fù)方苦參灌腸劑急性毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（±s）g

表3 復(fù)方苦參灌腸劑急性毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（±s）g

組別 n 性別 第1天 第2天 第3天 第4天 第7天 第1 0天 第1 4天正常對(duì)照組 1 0 雌 2 5.0±3.4 2 6.6±3.2 2 7.4±3.5 2 9.0±3.7 3 1.5±6.3 3 2.7±6.8 3 4.4±3.6 1 0 雄 2 9.1±1.4 3 0.7±2.0 3 2.1±2.3 3 3.1±3.7 3 6.9±2.9 3 9.0±3.2 4 1.1±3.7實(shí)驗(yàn)組 1 0 雌 2 2.9±2.3 2 5.0±2.5 2 5.7±2.7 2 6.1±3.3 2 8.7±4.1 3 0.2±3.9 3 1.6±2.4 1 0 雄 2 9.1±2.4 3 1.5±2.0 3 2.4±1.8 3 3.8±2.3 3 8.1±3.2 4 0.4±2.9 4 2.7±3.5

圖1 兩組小鼠各器官病理染色結(jié)果（200×）

表4 復(fù)方苦參灌腸劑直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn)大鼠死亡情況

表5 復(fù)方苦參灌腸劑直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量變化情況（±s）g

表5 復(fù)方苦參灌腸劑直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量變化情況（±s）g

組別 n 性別 給藥前 第1天 第7天 第1 4天正常對(duì)照組 1 0 雌 1 6 6.0± 9.2 1 6 7.2± 7.8 1 8 5.8±2 1.9 2 0 3.4±1 4.1 1 0 雄 1 9 6.0±1 2.1 1 9 7.1±1 1.9 1 9 9.5±1 5.7 2 1 4.7± 0.7實(shí)驗(yàn)組 1 0 雌 1 7 0.7±8.0 1 7 1.3±6.2 1 8 3.4±3.6 2 0 5.2±7.3 1 0 雄 1 9 7.9± 6.7 1 9 8.2± 7.1 2 1 9.4±2 3.4 2 7 7.2± 8.0

表6 給藥期評(píng)價(jià)結(jié)果

表7 停藥觀察期評(píng)價(jià)結(jié)果

圖2 兩組直腸病理檢查結(jié)果（200×）

8 結(jié)論

急性毒性實(shí)驗(yàn)表明復(fù)方苦參灌腸劑在最大給藥量時(shí)對(duì)小鼠內(nèi)臟無(wú)急性毒副作用，故臨床擬用灌腸劑量是安全的。直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn)表明復(fù)方苦參灌腸劑多次直腸給藥對(duì)大鼠直腸黏膜無(wú)刺激性，對(duì)黏膜組織無(wú)病理性損傷。因此該藥臨床灌腸給藥安全可靠，值得臨床推廣應(yīng)用。