王家皓 賁蕾潔 符茜 張揚(yáng) 鄭麗雪
摘要:以南苜蓿為原料,通過(guò)復(fù)合酶解協(xié)同乙醇法提取其葉片中的總黃酮。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化其最佳提取工藝,進(jìn)一步考察南苜蓿葉總黃酮對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制性能,再通過(guò)對(duì)羥基自由基的清除能力、DPPH自由基的清除能力測(cè)定其抗氧化性能。結(jié)果表明最佳提取工藝為:復(fù)合酶用量3.0%,酶解時(shí)間15.7 min,酶解溫度39.0 ℃。在此條件下,南苜蓿葉總黃酮得率達(dá)到(1.9±0.3)%。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,南苜蓿葉總黃酮對(duì)大腸桿菌ATCC 25922最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,簡(jiǎn)稱(chēng)MIC)為 0.15 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 25923 MIC為0.20 mg/mL。南苜蓿葉總黃酮對(duì)羥基自由基和DPPH均表現(xiàn)出一定的清除能力,當(dāng)樣品濃度為1.0 mg/mL時(shí),清除率分別為54.75%、88.48%,對(duì)DPPH自由基、羥自由基半數(shù)抑制濃度IC50分別為0.368、0.947 mg/mL。
關(guān)鍵詞:南苜蓿;葉片;總黃酮;提取工藝;復(fù)合酶解法;抑菌活性;抗氧化活性;清除率;最低抑菌濃度;半數(shù)抑制濃度
中圖分類(lèi)號(hào): TS201.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號(hào):1002-1302(2020)17-0201-05
南苜蓿是豆科苜蓿屬的一二年生草本植物,別稱(chēng)草頭、金花菜,主要分布于我國(guó)江浙一帶[1]。它在我國(guó)有悠久的栽培歷史,最早作為綠肥和飼料引用栽培[2]。南苜蓿對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求不高,所以其產(chǎn)量很大,而且生長(zhǎng)快速。南苜蓿具有清熱涼血、治療黃疸、降低膽固醇含量[3]等多種養(yǎng)生調(diào)理作用,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,其嫩芽中蛋白質(zhì)含量在28.5%以上,富含18種氨基酸以及豐富的維生素、礦物質(zhì)、微量元素等,具有高蛋白、高膳食纖維、低脂肪特征,加之口感清爽、甘甜,廣泛用于蔬菜食用[4]。
目前,針對(duì)南苜蓿的研究主要有3個(gè)方面:一是種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與遺傳多樣性研究[5-6];二是功能因子生理活性研究[7-8];三是化學(xué)成分提取鑒定。晏小云等從南苜蓿乙醇提取物中發(fā)現(xiàn)以芹菜素為代表的黃酮功能因子,但其生理作用機(jī)制尚不清楚,研究相對(duì)不夠深入[1]。本研究首次采用復(fù)合酶解協(xié)同乙醇法提取南苜蓿葉(主要食用部位)中的總黃酮,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,進(jìn)一步分析其抗菌及抗氧化性能,為蘇南地區(qū)南苜蓿資源的綜合開(kāi)發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)與試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。
1 材料與方法
1.1 材料
主要試驗(yàn)材料有南苜蓿(常熟當(dāng)?shù)?0月產(chǎn))、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、果膠酶、纖維素酶、無(wú)水乙醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、磷酸鹽緩沖液、綠礬(FeSO4·7H2O)、鄰二氮菲、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸,均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
主要試驗(yàn)儀器有PL602E/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]、DHG-9037A型恒溫干燥箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)、HH-11-2-S型水浴鍋(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、722-UV型紫外分光光度計(jì)(上海高致精密儀器有限公司)、HK-20B 1000g型粉碎機(jī)(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)、SHB-IIA型離心機(jī)(臨海市永昊真空設(shè)備有限公司)。
1.3 試驗(yàn)菌種
試驗(yàn)菌種主要有大腸桿菌(Escherichia coli) ATCC 25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 25923,菌種保藏于常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程中心。
1.4 培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基:10 g胰蛋白胨,5 g酵母提取物,10 g 氯化鈉,1 L蒸餾水,pH值為7.2~7.4。
1.5 試驗(yàn)方法
1.5.1 南苜蓿預(yù)處理 將南苜蓿葉置于70 ℃烘箱內(nèi)干燥至恒質(zhì)量,取出用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)20目篩網(wǎng),得到南苜蓿葉粉末,用袋子密封好放在通風(fēng)干燥處避光保藏,備用。
1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 參考余勇等的方法[8]制作蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以蕓香苷濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。本試驗(yàn)中得到線(xiàn)性回歸方程為y=12.595x-0.006 8,r2=0.998 7,表明在一定范圍內(nèi)吸光度與濃度的線(xiàn)性關(guān)系良好。
1.5.3 南苜蓿葉總黃酮的提取 稱(chēng)取2.5 g干燥后的南苜蓿葉粉末置于50 mL燒杯中,先加復(fù)合酶液25 mL,放入一定溫度的水浴鍋中酶解一定時(shí)間,之后轉(zhuǎn)移至80 ℃水浴鍋中滅酶10 min,取出后用乙醇加至50 mL,再放入40 ℃水浴鍋中提取10 min,取出后用真空抽濾機(jī)抽濾,濾液即為含有南苜??傸S酮的提取液。
1.5.4 南苜蓿葉總黃酮含量的測(cè)定 吸取0.5 mL南苜蓿葉總黃酮提取液置于25 mL比色管中,按“1.5.2”節(jié)下方法測(cè)吸光度。根據(jù)蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程,計(jì)算南苜蓿葉總黃酮的含量,然后計(jì)算得率。
總黃酮得率=C×25×50×100V×m×1 000×100%。
式中:C表示待測(cè)液總黃酮含量,mg/mL;V表示吸取的提取液的體積,mL;m表示提取用的樣品質(zhì)量,g。
1.5.5 單因素試驗(yàn) 選取復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間等3個(gè)因素,考察各因素對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率的影響。在進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí),固定復(fù)合酶添加量為1%、酶解溫度為40 ℃、酶解時(shí)間為 10 min,分別改變所對(duì)應(yīng)的設(shè)定因素,復(fù)合酶添加量為1%、2%、3%、4%、5%;酶解溫度為30、35、40、45、50 ℃;酶解時(shí)間為5、10、15、20、25 min。
1.5.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)前期的單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),然后進(jìn)行響應(yīng)面分析,確定最佳提取工藝。試驗(yàn)因素水平及相關(guān)情況見(jiàn)表1。
1.5.7 抑菌活性測(cè)定 采用梯度稀釋分析的方法確定南苜蓿葉總黃酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)[11]。
在無(wú)菌操作條件下,將各濃度梯度的南苜蓿葉總黃酮提取液各吸取2 mL,分別置于不同培養(yǎng)皿中,加入預(yù)先準(zhǔn)備好的LB培養(yǎng)基,充分混勻,凝固后在平板中分別加入0.2 mL大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液,涂布均勻,以無(wú)菌水和5%苯甲酸鈉為陰性和陽(yáng)性對(duì)照,將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每個(gè)濃度做平行試驗(yàn)3次。以不長(zhǎng)菌的最低濃度作為南苜蓿葉總黃酮的MIC。
1.5.8 抗氧化活性的測(cè)定
1.5.8.1 對(duì)DPPH·自由基清除能力的測(cè)定 將提取得到的南苜蓿葉總黃酮溶液配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同含量的樣品溶液,參照Cai等的方法[10]進(jìn)行DPPH·自由基清除能力測(cè)定。
1.5.8.2 對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定 將提取得到的南苜蓿葉總黃酮溶液配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同含量的樣品溶液,參照許建本等的方法[11]進(jìn)行羥基自由基清除能力的測(cè)定。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)
2.1.1 復(fù)合酶添加量的影響 在本試驗(yàn)中,復(fù)合酶質(zhì)量之比為1 g ∶ 1 g,由圖1可知,當(dāng)增加復(fù)合酶使用量時(shí),南苜蓿葉總黃酮得率逐漸上升;當(dāng)在復(fù)合酶添加量為3%時(shí),南苜蓿葉總黃酮得率最高,為1.49%;但隨著復(fù)合酶添加量增加,得率沒(méi)有持續(xù)升高反而出現(xiàn)了下降,這可能是因?yàn)槊柑砑恿窟^(guò)多,此時(shí)底物完全被酶包圍,植物細(xì)胞壁中的纖維素和果膠在酶的作用下產(chǎn)生的水解產(chǎn)物對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)的吸附性較強(qiáng)[12],所以復(fù)合酶添加量過(guò)多反而會(huì)使南苜蓿葉總黃酮得率降低。
2.1.2 復(fù)合酶酶解溫度的影響 由圖2可知,當(dāng)溫度小于40 ℃時(shí),隨著溫度的升高,南苜蓿葉總黃酮得率增大,是因?yàn)闇囟壬?,分子運(yùn)動(dòng)速度加快,使得細(xì)胞內(nèi)成分更容易溶出[13];當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí),隨溫度升高,南苜蓿葉總黃酮得率減小,這是因?yàn)槊副举|(zhì)上是蛋白質(zhì), 酶蛋白會(huì)因?yàn)闇囟壬叨冃允Щ?,因而浸提效果變差[14]。
2.1.3 復(fù)合酶酶解時(shí)間的影響 由圖3可知,總黃酮得率在酶解時(shí)間為15 min時(shí)最佳,達(dá)到1.45%,在酶解時(shí)間為 5~15 min內(nèi),南苜蓿葉總黃酮得率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而變高;之后隨著酶解時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng),得率有下降趨勢(shì)。
2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化南苜蓿葉總黃酮提取工藝
2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 通過(guò)對(duì)各試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析,得到總黃酮得率(y)回歸模型方程為:y=1.99+0.003 75A+0.045B-0.061C-0.078AB+0.001AC-0.013BC-0.2A2-0.17B2-0.31C2。南苜蓿葉總黃酮提取工藝的響應(yīng)面分析結(jié)果和回歸方程方差結(jié)果分析見(jiàn)表2、表3。
由表3可知,該模型P值=0.000 2<0.01,屬于差異極顯著模型;而失擬項(xiàng)的P值為0.802 3>0.05,差異不顯著,說(shuō)明該模型能夠預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果的分析;模型的確定系數(shù)R2值為0.967 8,R2adj為 0.926 4,說(shuō)明該試驗(yàn)所建立的模型擬合良好。
由3個(gè)影響因素的F值大小可以得出,各因素對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率的影響大小分別為酶解溫度>酶解時(shí)間>復(fù)合酶添加量。模型中因素一次項(xiàng)酶解溫度(C)對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率有顯著影響,二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率有極顯著影響,交互項(xiàng)中的復(fù)合酶添加量(A)與酶解時(shí)間(B)對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率影響顯著,其余項(xiàng)均不顯著。說(shuō)明各因素對(duì)南苜蓿葉黃酮得率的影響并不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系,而是存在一定的交互作用。
2.2.2 交互作用分析 根據(jù)響應(yīng)面回歸方程與方差分析、試驗(yàn)?zāi)P?,建立響?yīng)面試驗(yàn)3D結(jié)構(gòu)模型圖和等高線(xiàn)圖,結(jié)果見(jiàn)圖4至圖6。
由圖4至圖6可知,兩兩因素的交互作用對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率影響作用的3D模型開(kāi)口均是向下的,即當(dāng)2個(gè)因素水平均提高時(shí),南苜蓿葉總黃酮得率都升高;當(dāng)達(dá)到一個(gè)最高值即峰值時(shí),南苜蓿葉總黃酮得率達(dá)到最大;當(dāng)2個(gè)因素水平繼續(xù)升高,南苜蓿葉總黃酮得率則開(kāi)始下降。通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件的計(jì)算可得最佳提取工藝方案為:復(fù)合酶用量為3.0%,酶解時(shí)間為15.7 min,酶解溫度為 39.0 ℃,此時(shí)的得率為1.99%。
2.2.3 最佳提取方案驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)P偷臏?zhǔn)確性與可靠性,根據(jù)上述響應(yīng)面試驗(yàn)得到的酶輔助乙醇提取南苜蓿葉總黃酮的最佳提取方案,設(shè)定考察因素水平為:復(fù)合酶添加量3.0%,酶解時(shí)間15.7 min,酶解溫度39.0 ℃,對(duì)南苜蓿葉進(jìn)行酶解輔助乙醇提取總黃酮化合物,得到南苜蓿葉總黃酮得率為(1.9±0.3)%,與響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果相符,說(shuō)明此響應(yīng)面模型得到的南苜蓿葉總黃酮提取工藝在實(shí)踐中同樣可行。
2.3 抑菌活性的分析
由表4可知,南苜蓿總黃酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制效果,按照最低抑菌濃度測(cè)試方法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析,南苜蓿葉總黃酮對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.15 mg/mL,南苜蓿葉黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.2 mg/mL。
2.4 南苜蓿葉總黃酮抗氧化活性的測(cè)定
2.4.1 對(duì)DPPH·自由基清除能力的測(cè)定 由圖7可以看出,在0.2~1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),南苜蓿葉總黃酮的濃度與DPPH·的清除率成正比,即越高清除率越強(qiáng)。根據(jù)Excel 2010軟件分析,南苜蓿葉總黃酮對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50為0.368 mg/mL,維生素C對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50為0.108 mg/mL。
2.4.2 對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定 由圖8可知,質(zhì)量濃度范圍在0.2~1.0 mg/mL時(shí),南苜蓿葉總黃酮清除羥基自由基的能力隨著濃度的增加而增加,但最大值不超過(guò)60%;而維生素C對(duì)于羥基自由基的清除能力基本維持在70~90%之間。根據(jù)Excel 2010軟件分析,南苜蓿葉總黃酮對(duì)羥自由基的IC50為0.947 mg/mL,維生素C對(duì)羥自由基的IC50為0.049 mg/mL??寡趸囼?yàn)結(jié)果表明,南苜蓿葉總黃酮對(duì)羥基自由基和DPPH·均表現(xiàn)出一定的清除能力,但效果不如維生素C。
3 結(jié)論與討論
以常熟本地產(chǎn)的南苜蓿葉為原料,首次采用復(fù)合酶酶解協(xié)同乙醇法提取其中的總黃酮,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上,采用響應(yīng)面分析法對(duì)總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)南苜蓿葉總黃酮的抗氧化活性及抑菌作用進(jìn)行初步探索,為系統(tǒng)、合理、全面地開(kāi)發(fā)南苜蓿資源建立科學(xué)依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果表明,南苜蓿葉總黃酮的最佳提取工藝方案:復(fù)合酶添加量為3.0%,酶解時(shí)間為15.7 min,酶解溫度為39.0 ℃,在此工藝條件下,南苜蓿葉黃酮得率達(dá)到(1.9±0.3)%。抑菌試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),南苜蓿葉總黃酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等2種菌均有明顯的抑制作用,對(duì)大腸桿菌的MIC為0.15 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為 0.2 mg/mL。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明,南苜蓿葉總黃酮對(duì)羥基自由基和DPPH均表現(xiàn)出一定的清除能力,但效果不如維生素C。
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