產(chǎn)低毒性脂多糖大腸桿菌J5基因重組株的構(gòu)建

徐悅 周明旭 朱純 尹文竹 馬芳 鮑熹 張金秋 盧宇

摘要：細(xì)菌脂多糖（LPS）對(duì)宿主細(xì)胞具有一定的毒性，但經(jīng)修飾后的單磷酸類脂A（MPLA）卻是一種無(wú)毒性的高效免疫佐劑。選擇天然O抗原不完全的大腸桿菌J5疫苗株為出發(fā)菌株，利用λ-Red同源重組技術(shù)導(dǎo)入外源弗朗西斯菌（Francisella novicida）lpxE基因，缺失大腸桿菌lpxM基因。結(jié)果顯示，J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM基因重組株的LPS鱟試劑活性較DH5α和J5原菌顯著降低;對(duì)4周齡的ICR小鼠腹腔注射LPS提取物，重組菌和PBS組的小鼠體征及肝臟切片均正常。同時(shí)，腹腔注射大腸桿菌J5和DH5α的小鼠被毛凌亂、精神抑郁、肝臟細(xì)胞腫大，發(fā)生炎性浸潤(rùn)，有明顯的毒性反應(yīng)。以上結(jié)果說(shuō)明，J5重組菌的LPS已經(jīng)區(qū)別于原菌，是低毒性的MPLA產(chǎn)物。上述重組株的成功構(gòu)建，能為生產(chǎn)廉價(jià)的獸用MPLA免疫佐劑奠定工作基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌;MPLA;Red同源重組;佐劑;疫苗;細(xì)菌脂多糖

中圖分類號(hào)：S182 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）17-0054-05

細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）主要由類脂A、核心多糖和O-抗原3部分組成，其中類脂A是LPS的活性中心，其保守的結(jié)構(gòu)可以被宿主細(xì)胞表面的Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）識(shí)別并引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致機(jī)體休克或者死亡，因此LPS又被成為內(nèi)毒素[1]。單磷酸類脂A（monophosphoryl lipid A，MPLA）是類脂A在酶的催化作用下水解失去1-磷酸（或1-焦糖酸）后所形成的一種類脂A的衍生物，幾乎失去了LPS的毒性，但是仍舊能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生各種免疫活性因子，激活吞噬細(xì)胞，MPLA具備一定的免疫佐劑和免疫調(diào)理的作用[2-3]。

大腸桿菌J5（O111：B4）菌株是美國(guó)Pfizer公司推出的用于奶牛乳房炎滅活菌苗的疫苗株[4]。它是1株O-抗原不完全的粗糙型（R）突變菌，其LPS只含有結(jié)構(gòu)較為單一的Kdo2-類脂A和核心多糖結(jié)構(gòu)。因J5株暴露的核心抗原具有良好的保守性和天然免疫原性，它作為抗革蘭氏陰性菌感染的疫苗株在奶牛等家畜上被廣泛應(yīng)用[5-7]?？紤]到J5株的LPS天然缺失O抗原且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，30多年的疫苗使用情況顯示其安全性可靠，因此本研究選擇J5株作為出發(fā)菌。通過(guò)同源重組技術(shù)將J5株基因組乳糖操縱子lac的抑制子基因lacI置換為弗朗西斯氏菌屬（Francisella）的lpxE基因，達(dá)到常量表達(dá)的效果，該基因編碼的磷酸酶可以選擇性地降解存在于類脂A分子C1位上的磷酸基團(tuán)，使其LPS成為MPLA結(jié)構(gòu)[8]。與此同時(shí)，缺失J5株的lpxM基因，使細(xì)菌類脂A的分子C3′位無(wú)法正常添加十四碳羥基脂肪酸鏈，從而只存在5條?；?，進(jìn)一步降低LPS對(duì)TLR4的激活效率，減少M(fèi)PLA的毒性[9]。對(duì)J5株的LPS進(jìn)行定向重組改造使其成為可以產(chǎn)低毒性MPLA的工程菌，應(yīng)用于獸用佐劑的生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與試驗(yàn)動(dòng)物

大腸桿菌J5株（O111：B4）、Red重組系統(tǒng)質(zhì)粒pKD3和pCP20由揚(yáng)州大學(xué)朱國(guó)強(qiáng)教授惠贈(zèng);弗朗西斯菌（F.novicida）基因組DNA由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)蘇敬良教授惠贈(zèng);（20±2） g的清潔級(jí)ICR雌鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

胰蛋白酶（tryptone）、酵母提取物（yeast extract），購(gòu)自O(shè)xoid公司;瓊脂（agar），購(gòu)自南京翼飛雪生物科技有限公司;β-半乳糖苷酶（ONPG）、L-阿拉伯糖、氯霉素（Cm）和氨芐青霉素（Amp），均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;DL 2 000 DNA Marker、Ex Taq（10 U/L）、dNTP，均購(gòu)自TaKaRa公司;DNA膠回收試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;Trans2K plusⅡ DNA Marker、克隆載體pEASY-T1 Simple和感受態(tài)細(xì)胞，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;顯色基質(zhì)鱟試劑盒，購(gòu)于廈門(mén)鱟試劑廠。

1.3 低毒性LPS重組株的構(gòu)建

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上發(fā)布的大腸桿菌（Escherichia coli） lacI基因和F.novicida lpxE基因序列，設(shè)計(jì)3對(duì)引物，P1、P2位于E.coli J5株中的lacI基因ORF的上下游外翼，用于擴(kuò)增檢測(cè)lacI基因及其缺失突變株。其后在P1、P2內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)1對(duì)同源重組引物P3、P6，其5′端序列與lacI兩翼序列同源，P2的3′端序列與lpxE基因序列同源，P6的3′端序列與cat基因序列同源。依照重疊延伸PCR（SOE-PCR）要求設(shè)計(jì)P4、P5，其中P4的5′端序列與cat基因序列同源，3′端序列與lpxE基因序列同源。再根據(jù)GenBank上發(fā)布的E.coli lpxM基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，P7、P8位于E.coli J5株中的lpxM基因ORF的上下游外翼，用于擴(kuò)增檢測(cè)lpxM基因及其缺失突變株。另外，在P7、P8內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)1對(duì)同源重組引物P9、P10，其5′端序列與lpxM兩翼序列同源，3′端序列與cat基因序列同源。引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.3.2 Red重組構(gòu)建J5ΔlacI：：lpxE 為將lpxE基因插入細(xì)菌基因組并常量表達(dá)，試驗(yàn)選擇lac操縱子中抑制子lacI基因作為插入位點(diǎn)，利用Red重組技術(shù)用lpxE基因置換lacI基因。

PCR反應(yīng)1以F.novicida基因組為模板，P3、P4為引物，擴(kuò)增lpxE基因;反應(yīng)2以質(zhì)粒pKD3為模板，P5、P6為引物，擴(kuò)增cat基因。反應(yīng)1和反應(yīng)2按照常規(guī)PCR的方法進(jìn)行操作，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后通過(guò)DNA膠回收并送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。SOE-PCR以反應(yīng)1和反應(yīng)2的產(chǎn)物為模板，P3和P6為引物，按照文獻(xiàn)[10]方法，分2輪PCR擴(kuò)增lpxE-cat重組片段。最后產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收后-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

按照文獻(xiàn)[11]中的方法向已經(jīng)導(dǎo)入pKD46的J5株感受態(tài)細(xì)胞中電轉(zhuǎn)lpxE-cat重組片段，通過(guò)氯霉素抗性平板篩選1次同源重組菌J5ΔlacI：：lpxE-cat，并進(jìn)行PCR鑒定。然后向陽(yáng)性菌種導(dǎo)入編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，通過(guò)對(duì)Flp位點(diǎn)的識(shí)別消除抗性基因，獲得二次重組菌J5ΔlacI：：lpxE，利用P1、P2引物擴(kuò)增目的片段，送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3.3 Red重組構(gòu)建J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM 以構(gòu)建的J5ΔlacI：：lpxE重組株為出發(fā)菌株，繼續(xù)構(gòu)建lpxM缺失株。以pKD3為模板，P9、P10為引物，按照文獻(xiàn)[11]方法擴(kuò)增cat基因，DNA膠回收后-20 ℃凍存?zhèn)溆?。重組的具體方法同“1.3.2”節(jié)，分別通過(guò)一次重組和二次重組構(gòu)建J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM重組株，利用P7、P8引物擴(kuò)增目的片段，送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.4 β-半乳糖苷酶試驗(yàn)檢測(cè)lac操縱子的表達(dá)

β-半乳糖苷酶試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。將J5株和J5△lacI：：lpxE重組株分別接種4 mL于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管，放置在搖床中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)細(xì)菌8 h。收集菌液，10 000 r/min離心10 min，取培養(yǎng)上清備用。按照文獻(xiàn)[13]方法，配制0.02 mol/L ONPG底物溶液，過(guò)濾除菌，分裝成1 mL/管。分別在每管中加入100 μL的培養(yǎng)上清，另設(shè)置1管加入PBS作為空白對(duì)照，放置在37 ℃水浴鍋中共孵育6 h，觀察底物溶液顏色變化。

1.5 細(xì)菌LPS的提取和純化

細(xì)菌LPS的提取和純化按照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。挑取J5株及重組株至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜，并轉(zhuǎn)接至500 mL細(xì)菌培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)8 h。收菌時(shí)檢測(cè)菌液的吸光度D600 nm。菌液6 000 r/min離心20 min，并以1 ∶ 10比例濃縮。濃縮菌液在-20 ℃下反復(fù)凍融3 次;加入溶菌酶（含50 μg/mL），37 ℃水浴60 min。低溫條件下超聲破碎菌體，之后將菌液移至200 mL玻璃瓶中，在68～70 ℃下預(yù)加熱，加入新配制的等體積90%苯酚（體積分?jǐn)?shù)），68～70 ℃下反應(yīng)30 min，期間每 5 min 搖晃振蕩樣品，使反應(yīng)充分進(jìn)行。結(jié)束后將混合液轉(zhuǎn)移至離心杯中，并保存于 4 ℃ 過(guò)夜。次日 3 000 r/min 離心樣品30 min后取上清，在剩余酚相中加入等體積的ddH2O，重復(fù)提取1次，合并2次水相，并移至透析袋中。充分透析去除苯酚后，使用聚乙二醇（PEG 8000）濃縮，使體積至原液的1/5～1/6。將透析袋內(nèi)濃縮液吸出，離心（4 ℃，3 000 r/min，30 min）取上清，即為L(zhǎng)PS粗制品。

在LPS粗制品中加入DNase I和Rnase A，37 ℃水浴60 min，然后置于65 ℃下10 min滅活酶。之后5 000 r/min離心10 min，去除沉淀，將上清凍干處理，得到LPS凍干粉。凍干粉稱質(zhì)量，計(jì)算得率，并加入滅菌ddH2O復(fù)溶，配制成1 mg/mL的LPS純品。

1.6 鱟試劑檢測(cè)LPS活性

按照鱟試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法配制內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按比例稀釋1.5倍，獲得LPS待測(cè)樣品，根據(jù)說(shuō)明試驗(yàn)步驟進(jìn)行顯色，使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定545 nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)讀值結(jié)果建立內(nèi)毒素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算LPS樣品的活性。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)LPS毒性

選取20 g ICR雌鼠40只，10只/組進(jìn)行分組，設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。稀釋1.5倍，獲得J5、J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM和DH5α的LPS提取物至500 μg/mL，試驗(yàn)組分別腹腔注射不同LPS提取物（劑量5 mg/kg），注射量為200 μL/只，空白對(duì)照組注射200 μL PBS。觀測(cè)攻毒后小鼠的生理精神狀態(tài)（食欲、飲欲及活動(dòng)狀況等）和病癥，并在攻毒2 d后剖殺小鼠，取肝臟制作石蠟切片，觀察其組織病理變化從而判定不同LPS提取物的毒性強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 J5Δlac I：：lpxEΔlpxM重組株的鑒定

將二次重組菌制備基因組模板，以P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，對(duì)照野生型擴(kuò)增片段為 1 200 bp，重組菌擴(kuò)增片段為888 bp（圖1），PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果正確。以P7和P8為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增lpxM基因鑒定，對(duì)照野生型擴(kuò)增片段為 1 066 bp，重組菌擴(kuò)增片段為179 bp（圖2），PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果正確，命名重組菌為J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM。

2.2 β-半乳糖苷酶試驗(yàn)檢測(cè)lac操縱子的表達(dá)

由圖3可知，J5野生菌和J5ΔlacI：：lpxE培養(yǎng)上清分別加入底物ONPG孵育后，J5野生菌培養(yǎng)液不變色;J5ΔlacI：：lpxE培養(yǎng)液顯黃色，說(shuō)明重組株lac操縱子可正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)，lpxE基因置換lacI成功。

2.3 脂多糖產(chǎn)量比較

J5株及重組株的LPS水溶物均為無(wú)色透明液，凍干后為白色粉末狀。根據(jù)LPS凍干產(chǎn)物稱質(zhì)量的結(jié)果，計(jì)算出得率，見(jiàn)表1。

2.4 內(nèi)毒素活性檢測(cè)

鱟試劑中含有能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，是一種凝固蛋白原，能準(zhǔn)確、快速地定性或定量檢測(cè)樣品中是否含有細(xì)菌內(nèi)毒素[8-9]。根據(jù)定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算公式為Y=0.819 0X+0.305 2，r2=0.990 2。推算測(cè)得DH5α的LPS活性為2.3×105 EU/mg，J5原菌的LPS活性為1.7×105 EU/mg，改造菌株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS活性為4.3×103 EU/mg。改造菌株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS活性較DH5α和J5原菌顯著降低，說(shuō)明重組菌株改造成功。

2.5 LPS毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 臨床癥狀 通過(guò)對(duì)小鼠分別依次腹腔注射野生株J5，突變株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM以及DH5α的LPS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌J5和DH5α的LPS提取物攻毒組，小鼠被毛凌亂、精神抑郁、有明顯毒性反應(yīng);而PBS組和J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS提取物組的小鼠正常，無(wú)任何臨床癥狀。說(shuō)明經(jīng)改造的突變株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS毒性明顯降低。

2.5.2 組織病理變化 對(duì)攻毒小鼠的肝臟組織進(jìn)行病理切片，由圖4可知，DH5α組和J5組的肝臟細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙增大，同時(shí)出現(xiàn)不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。相對(duì)于DH5α組和J5組，J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM組肝臟細(xì)胞與PBS組的肝臟細(xì)胞形態(tài)一致，沒(méi)有明顯的病理變化，僅發(fā)生局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。說(shuō)明改造后的J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM突變株的毒性減弱。

3 結(jié)論與討論

細(xì)菌LPS會(huì)最大程度地激活機(jī)體TLR4、Notch[15]通路， 引起細(xì)胞毒性反應(yīng)。已有研究表明，

改變脂肪酸鏈的數(shù)量、長(zhǎng)度以及磷酸基團(tuán)個(gè)數(shù)均可降低LPS的毒性，使其發(fā)揮佐劑作用[16]，其中，MPLA作為類脂A的結(jié)構(gòu)變體，是一種免疫效力顯著的佐劑物質(zhì)。其傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是收獲R型沙門(mén)菌突變株R595的LPS，并對(duì)其LPS采用酸解、堿解等一系列繁瑣的化學(xué)手段脫去磷酸基團(tuán)及?；湯@得。但該類產(chǎn)物的產(chǎn)率較低，MPLA純度無(wú)法保障，存在多種不同的陽(yáng)離子使其溶解度降低，可能發(fā)生沙門(mén)菌污染，生產(chǎn)成本極高。

本研究選用O抗原不完全的大腸桿菌J5疫苗株作為出發(fā)菌，利用λ-Red同源重組技術(shù)，從生物合成學(xué)的角度對(duì)細(xì)菌完成基因改造，使細(xì)菌直接合成MPLA。其中非常重要的改造位點(diǎn)是導(dǎo)入可以去除磷酸基團(tuán)的弗朗西斯菌的lpxE基因并保證常量表達(dá)，因此筆者所在課題組選擇lac操縱子中常量表達(dá)的lacI基因作為重組位點(diǎn)。lacI具備獨(dú)立的啟動(dòng)子，可在非乳糖培養(yǎng)環(huán)境下常量表達(dá)，J5野生菌中β-半乳糖苷酶LacZ在抑制子LacI的作用下轉(zhuǎn)錄被阻遏;當(dāng)lacI基因的ORF被完成置換為lpxE的ORF后，細(xì)菌常量表達(dá)LpxE而非LacI，原阻遏效應(yīng)結(jié)束，LacZ則開(kāi)始轉(zhuǎn)錄表達(dá)并催化底物ONPG，顯示黃色;同時(shí)，常量表達(dá)的LpxE也保證了細(xì)菌LPS可以被催化轉(zhuǎn)變?yōu)镸PLA結(jié)構(gòu)。

導(dǎo)致腹瀉的野生豬源大腸桿菌LPS的活性可以達(dá)到1.21×107 EU/mg，Sigma公司市售的LPS活性約為1×105 EU/mg[17]。而本研究中使用的大腸桿菌J5株由于其自身作為疫苗株的安全性優(yōu)勢(shì)，經(jīng)筆者所在課題組測(cè)定LPS活性僅1.7×105 EU/mg，顯著低于豬源野生大腸桿菌。但從小鼠的毒性試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，J5株的LPS仍然可以引起小鼠包括被毛凌亂、精神抑郁等臨床反應(yīng)，肝臟組織也存在明顯的病變。相對(duì)于J5野生株以及DH5α，經(jīng)改造J5菌株的LPS提取物對(duì)小鼠沒(méi)有造成明顯的臨床癥狀，且肝臟組織切片也確定沒(méi)有明顯病變，說(shuō)明該改造菌株的MPLA毒性顯著低于原野生株，該改造菌株更安全。

盡管本研究已經(jīng)成功構(gòu)建了J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM重組菌，但是其產(chǎn)生的MPLA的佐劑效力仍有待進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物免疫試驗(yàn)驗(yàn)證和評(píng)估。而利用基因重組改造菌株生產(chǎn)并提取MPLA的技術(shù)思路，可以直接減少原生產(chǎn)的化學(xué)工藝流程中酸解和堿解的步驟，提高產(chǎn)品純度和產(chǎn)率，顯著降低生產(chǎn)成本，從而將廉價(jià)、高效的MPLA佐劑應(yīng)用于獸用疫苗。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wang X Y，Quinn P J. Endotoxins：structure，function and recognition[M]. Berlin：Springer，2010.

[2]Gregg K A，Harberts E，Gardner F M，et al. Rationally designed TLR4 ligands for vaccine adjuvant discovery[J]. Mbio，2017，8（3）：e00417-e00492.

[3]Schülke S，F(xiàn)laczyk A，Vogel L，et al. MPLA shows attenuated pro-inflammatory properties and diminished capacity to activate mast cells in comparison with LPS[J]. Allergy，2015，70（10）：1259-1268.

[4]Tomita G M，Todhunter D A，Hogan J S，et al. Immunization of dairy cows with an Escherichia coli J5 lipopolysaccharide vaccine[J]. Journal of Dairy Science，1995，78（10）：2178-2185.

[5]Abdulaziz T A. Elsukhon S N. Chickens hyperimmunized with Escherichia coli J5 strain are protected against experimental challenge with Escherichia coli O78 serotype[J]. Veterinary Research Communications，1998，22（1）：7.

[6]Aslam M，Whitemore H L，Kakoma I. Effect of E.coli J5 vaccine and intramammary challenge with live Escherichia coli in lactating dairy goats[J]. Small Ruminant Research，1995，17（3）：275-281.

[7]王 剛. E.coli J5菌苗對(duì)兔實(shí)驗(yàn)性感染巴氏桿菌的保護(hù)作用[J]. 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2000（3）：48-49.

[8]李顏顏. 弗朗西斯菌類脂A的結(jié)構(gòu)多樣性及其分子機(jī)制研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué)，2012.

[9]李顏顏，史 鋒，李 燁，等. 細(xì)菌類脂A結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2008，48（6）：844-849.

[10]Horton R M，Cai Z L，Ho S N，et al. Gene splicing by overlap extension：tailor-made genes using the polymerase chain reaction，BioTechniques，1990，8（5）：528-535.

[11]郭志燕. FimA介導(dǎo)F18ab+大腸桿菌病原性的研究[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2014.

[12]胡會(huì)杰，周明旭. 豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌eltA、flhD、fimA、faeG基因啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)，克隆和鑒定[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（10）：1640-1645.

[13]Buelow P. The ONPG test in diagnostic bacteriology. Comparison of the ONPG test and the conventional lactose-fermentation test[J]. Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica，1964，60（3）：387-402.

[14]Li Y，Powell D A，Shaffer S A，et al. LPS remodeling is an evolved survival strategy for bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109（22）：8716-8721.

[15]朱麗華，熊御云，夏 琳，等. 積雪草酸預(yù)處理對(duì)膿毒癥小鼠急性腎損傷的影響及機(jī)制[J]. 山東醫(yī)藥，2017，57（30）：10-13.

[16]Kanistanon D，Hajjar A M，Pelletier M R，et al. A francisella mutant in lipid a carbohydrate modification elicits protective immunity[J]. PLoS Pathogens，2008，4（2）：e24.

[17]馮 將，王玉坤，魏玉好，等. 豬源大腸桿菌脂多糖的提取、純化及活性分析[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2017，44（3）：912-919.