多菌靈降解菌djl-6和啶蟲脒降解菌D-2液體菌劑的研發(fā)

徐銘陽 盧家森 耿翔 劉卜郡 何健 黃星

摘要：以長期受多菌靈和啶蟲脒農(nóng)藥污染的土壤中分離篩選得到的多菌靈降解菌株慶笙紅球菌（Rhodococcus qingshengii sp. nov. ）djl-6和啶蟲脒降解菌株噬染料菌（Pigmentiphaga sp. ）D-2為供試菌株，研究了降解菌菌劑的不同保存劑型與初步應(yīng)用的情況。結(jié)果表明，2株降解菌均以苯甲酸鈉作為防腐劑的處理效果最好，能維持活菌數(shù)較高且不產(chǎn)生雜菌污染。降解菌djl-6復(fù)配保護劑的最佳使用濃度：0.30%檸檬酸鈉、0.30%羧甲基纖維素、0.20% CaCl2。降解菌D-2復(fù)配保護劑的最佳使用濃度：0.20%糊精、0.20%檸檬酸鈉、0.30% CaCl2。與對照相比，添加保護劑后，菌株djl-6、菌株D-2活菌數(shù)分別夠提高32.03%、38.70%。2株菌的液體菌劑保存45 d后，降解菌djl-6能夠在10 d內(nèi)將土壤5 mg/kg多菌靈降解95.23%，降解菌D-2能夠在10 d內(nèi)將土壤5 mg/kg啶蟲脒降解92.75%，有效延長了液體菌劑的保存期。

關(guān)鍵詞：多菌靈降解菌;啶蟲脒降解菌;液體菌劑;保存條件

中圖分類號： X172 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0270-06

設(shè)施農(nóng)業(yè)作為農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)越來越受到各國政府的重視，設(shè)施農(nóng)業(yè)不僅有效解決了我國淡季期間蔬菜短缺問題，還促進了居民傳統(tǒng)消費結(jié)構(gòu)的改變[1]。但是設(shè)施農(nóng)業(yè)中蔬菜病蟲害較多，農(nóng)藥的使用率也相對較高，以多菌靈和啶蟲脒為代表的農(nóng)藥因其高效低毒的特點[2-4]而被廣泛應(yīng)用于設(shè)施農(nóng)業(yè)之中。多菌靈是一種內(nèi)吸性的廣譜殺菌劑，土壤中殘留的多菌靈會導(dǎo)致土壤微生物數(shù)量下降，抑制土壤脫氫酶、磷酸酶活性[5-6]。啶蟲脒是一種內(nèi)吸殺蟲劑，殘留在土壤中會抑制土壤固氮菌、放線菌活性，對土壤動物產(chǎn)生慢性毒性[7-8]。

應(yīng)用微生物修復(fù)農(nóng)藥殘留污染是一種公認的安全有效的方法。目前，我國農(nóng)藥殘留相關(guān)研究主要集中在高效降解菌株的篩選和培育上，在微生物菌劑的開發(fā)應(yīng)用方面的研究仍然不夠完善[9-11]。微生物作為一種活體生物，其保存情況極易受到外界環(huán)境的影響，微生物液體菌劑的儲存一直是阻礙降解菌菌劑的大規(guī)模應(yīng)用的難題，而目前關(guān)于微生物液體菌劑保存條件的研究非常少[12-14]。筆者所在實驗室分離并保藏了多菌靈、啶蟲脒降解菌株，其中多菌靈降解菌株能在7 d內(nèi)將5 mg/kg多菌靈降解80.0%，啶蟲脒降解菌株在5 d內(nèi)將 10 mg/kg 啶蟲脒降解90.0%。由于液體菌劑中的微生物易受周圍環(huán)境影響從而導(dǎo)致菌劑保存期短，本研究首先篩選出了2個菌株的液體菌劑防腐劑及其使用濃度，研究了菌劑不同保藏條件對其活菌數(shù)以及降解率的影響，以期為農(nóng)藥降解菌菌劑的保存與應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

多菌靈原藥購自江蘇省新沂農(nóng)藥有限公司（純度99.8%）。啶蟲脒原藥購自綠源制藥集團（純度98.3%）。無機鹽培養(yǎng)基：硝酸銨1.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，氯化鈉1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH值7.0。

LB培養(yǎng)基：酵母浸出物5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，超純水1 L，pH值7.0，固體培養(yǎng)基加入1.5%～2.0%的瓊脂。

D-2發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖9 g/L，硫酸銨 0.9 g/L，酵母膏0.3 g/L，氯化鈉0.1 g/L，碳酸鈣 1 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH值7.0～7.2。

djl-6發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8 g/L，硫酸銨 0.8 g/L，酵母膏0.2 g/L，氯化鈉0.1 g/L，碳酸鈣0.5 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH值7.0～7.2。

1.2 供試菌株、供試作物與土壤

多菌靈降解菌株慶笙紅球菌（Rhodococcus qingshengii sp. nov. ）djl-6，啶蟲脒降解菌株噬染料菌（Pigmentiphaga sp. ）D-2，均由筆者所在實驗室分離并保藏。

供試青菜品種為上海青，購自南陽青青種業(yè)。

供試土壤為黃棕壤，采集于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓試驗基地。

1.3 液體菌劑防腐劑的篩選

1.3.1 防腐劑的初篩 設(shè)置菌株djl-6、菌株D-2這2組處理，每組處理取12個已滅菌的500 mL三角瓶（共24個）。每種菌設(shè)置4個防腐劑添加處理，依次為丙酸鈣、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、不添加試劑（CK），每個處理3個平行，共12個。每個處理依次加入相應(yīng)的已發(fā)酵的菌株發(fā)酵液300 mL和添加量為發(fā)酵液的0.50%（1.5 mL）的防腐劑，CK為不添加防腐劑的對照組，添加等體積（1.5 mL）的無菌水。用封口膜封緊，置于常溫條件下避光保存。放置3 d后，取樣，采用稀釋涂布平板法對菌株djl-6、菌株D-2以及雜菌進行計數(shù)，并計算雜菌率[15-16]。

1.3.2 防腐劑的復(fù)篩 根據(jù)防腐劑的初篩結(jié)果，分別向菌株djl-6和菌株D-2發(fā)酵液中添加苯甲酸鈉作為防腐劑，添加量分別為發(fā)酵液的0.10%、0.30%、0.50%、0.70%、1.00%，同時設(shè)置不添加苯甲酸鈉的對照，后續(xù)操作同“1.3.1”節(jié)。

1.4 液體菌劑保護劑的篩選

1.4.1 單因子保護劑的篩選 分別挑取菌株djl-6、菌株D-2的單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，放置于30 ℃搖床中160 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以1%接種量接入到盛有500 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。在無菌條件下裝入已高溫滅菌的50 mL無菌管中，再分別加入預(yù)先初篩過的氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、糊精、黃腐酸、羧甲基纖維素、甲酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉試劑作為助劑，使試管中的助劑添加量分別為0.10%和0.20%，同時設(shè)置不加助劑的對照，并向?qū)φ占尤胂嗤w積的無菌水，每個處理設(shè)置3個平行。30 d 后取樣，通過稀釋涂布平板法計算有效活菌數(shù)。

2.4 液體菌劑對土壤中農(nóng)藥殘留的降解效果

按照“2.2.2”節(jié)中保護劑的配比分別將保護劑加入到djl-6、D-2的液體菌劑中保存45 d后，取 10 mL 菌劑各自加入到干土中含量為5 mg/kg多菌靈及啶蟲脒干土的塑料杯中，10 d后測定土壤中農(nóng)藥的殘留量，并計算降解率。如圖3、圖4所示，djl-6 液體菌劑對土壤中農(nóng)藥殘留降解率最高的組合為正交組合9，10 d內(nèi)降解率達95.23%;其他組合的降解率與CK（不加任何保護劑）相比也有明顯提高，而在相同條件下CK降解率只能達到48.82%。D-2液體菌劑對土壤中農(nóng)藥殘留降解率最高的組合為正交組合5，10 d內(nèi)其降解率達到了92.75%，其他組合的降解率與CK（不加任何保護劑）相比也有明顯提高，而CK在相同條件下降解率只能達到41.21%。

3 討論與結(jié)論

微生物液體菌劑因工藝簡單、制作成本低被廣泛使用，但由于微生物極易受到周圍環(huán)境的影響，在運輸、保存、使用過程中菌劑的活性會發(fā)生變化[17-19]，如何提高菌劑的活性以及有效菌存活率成為活菌制劑亟需解決的難題。研究表明，向菌劑中添加保護劑以及抑制劑可以提高菌劑的活性，降低菌劑產(chǎn)品的污染率[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，加入防腐劑苯甲酸鈉后，與對照組相比雜菌率大大降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)苯甲酸鈉的添加量達到一定值后，不會出現(xiàn)雜菌污染，這與車建美等的研究結(jié)果[21]一致。這說明防腐劑的加入有效地抑制了雜菌的生成，使多菌靈、啶蟲脒降解菌株更好發(fā)揮功能。李劍峰等選擇了青霉素作為保護劑加入到解磷菌劑中使得目標菌的增值速度變慢，提升了菌種的活力[22]。本研究通過正交試驗研究出了保護劑的最佳組合，加入保護劑后，多菌靈、啶蟲脒降解菌株的活菌數(shù)增加，液體菌劑保存30 d仍具有明顯的降解效果，這表明保護劑的加入延長了菌劑的使用期。本研究均在盆缽中進行，下一步農(nóng)藥殘留污染土壤的修復(fù)工作將在田間進行，實時監(jiān)測菌株djl-6和菌株D-2在試驗田中定殖的生物量和對農(nóng)藥的降解。

本研究表明，通過添加苯甲酸鈉、丙酸鈣、山梨酸鉀3種具有抑菌防霉作用的防腐劑，分別對菌株djl-6和菌株D-2的雜菌率進行計算，發(fā)現(xiàn)2株降解菌均以苯甲酸鈉作為防腐劑效果最好。通過液體菌劑保護劑的正交篩選，降解菌djl-6復(fù)配保護劑的最佳添加量為0.10%的檸檬酸鈉、0.30%的羧甲基纖維素、0.20%的CaCl2。降解菌D-2復(fù)配保護劑的最佳添加量為0.10%的糊精、0.20%的檸檬酸鈉、0.30%的CaCl2。通過正交試驗篩選的菌劑助劑能夠有效提高細菌存活率，其中djl-6的發(fā)酵液中活菌數(shù)能夠提高32.03%，D-2的發(fā)酵液中的活菌數(shù)能提高38.70%。添加有保護劑保存30 d的菌株djl-6的液體菌劑在3 d內(nèi)最多能夠降解93.65%的50 mg/L多菌靈，添加有保護劑保存30 d的菌株D-2的液體菌劑在3 d內(nèi)最多能夠降解85.32%的50 mg/L啶蟲脒。添加有保護劑的保存45 d的菌株djl-6的液體菌劑，在10 d內(nèi)能將干土中含量為5 mg/kg的多菌靈降解95.23%。添加有保護劑的保存45 d的菌株D-2的液體菌劑，在 10 d 內(nèi)能將干土中含量為5 mg/kg的啶蟲脒降解92.75%。本研究為農(nóng)藥降解菌菌劑的生產(chǎn)應(yīng)用及保存提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Wang Y C，Zhou Q Y. Evaluation of development of agricultural modernization in central China[J]. IERI Procedia，2013，4：417-424.

[2]Burrows L A，Edwards C A. The use of integrated soil microcosms to assess the impact of carbendazim on soil ecosystems[J]. Ecotoxicology，2004，13（1/2）：143-61.

[3]Sousa J P，Gestel C A M V，Loureiro S E，et al. Ring-testing and field-validation of a terrestrial model ecosystem （TME）—an instrument for testing potentially harmful substances：effects of carbendazim on soil microbial parameters[J]. Ecotoxicology，2004，13（1/2）：61-74.

[4]宋 超，周楊全，李義強，等. 三種新煙堿類殺蟲劑在土壤中的殘留降解及影響因子[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2016，18（6）：738-744.

[5]龔芬芬. 多菌靈降解菌的分離鑒定、生物學(xué)特性及多菌靈水解酶基因的克隆和表達研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：13-16.

[6]陳 銳，孫曉宇，鄧 媛，等. 多菌靈降解菌的生物學(xué)特性及降解能力研究[J]. 生物技術(shù)通報，2018，34（5）：187-194.

[7]劉少偉，阮贊林. 啶蟲脒超標青菜[J]. 質(zhì)量與標準化，2018，3（79）：40-41.

[8]諸 力，王 晨，陳紅平，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定茶葉中11種植物生長調(diào)節(jié)劑及吡蟲啉、啶蟲脒的殘留[J]. 分析化學(xué)，2017，45（4）：529-536.

[9]陳揚波，卞杰松，劉彩霞，等. 生物有機肥中微生物的分離鑒定及液體菌劑的構(gòu)建[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，46（5）：54-59.

[10]張曉波. 在玉米上應(yīng)用微生物菌劑（液體）效果探討[J]. 農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備，2016（6）：63-64.

[11]Kaur T，Toor A P，Wanchoo R K. Parametric study on degradation of fungicide carbendazim in dilute aqueous solutions using nano TiO2[J]. Desalination & Water Treatment，2015，54（1）：122-131.

[12]詹 祎，王云鵬，郭堅華. 保護劑和再水化劑對冷凍干燥保存的生防菌YT11的存活率及生防效果的影響[J]. 中國生物防治學(xué)報，2011，27（1）：110-114.

[13]劉振華，邢雪琨. 微生物農(nóng)藥助劑研究進展[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016，35（8）：2109-2113.

[14]胡青青，沈文忠，張緒美，等. 新型微生物菌劑對小青菜生長及品質(zhì)的影響[J]. 上海農(nóng)業(yè)科技，2019（2）：116-118.

[15]張安龍，王 曄，王雪青，等. 一株高效苯酚降解真菌的分離鑒定及其菌劑的制備[J]. 微生物學(xué)通報，2018，45（7）：1450-1461.

[16]吳皓瓊，沙長青，牛彥波，等. 保護劑與防腐劑對生物肥料保存期的影響[J]. 生物技術(shù)，2004，14（6）：55-56.

[17]王 婧，方 蕊，蔣秋悅，等. 載體和保護劑對橘黃假單胞菌JD37微生物肥料活性的影響[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，41（2）：179-185.

[18]李春光，張建萍，余柳青. 助劑在微生物除草劑中的應(yīng)用[J]. 中國生物防治，2006，22（4）：265-267.

[19]高鶴南，趙巍巍，馬曉亮，等. 降解煙嘧磺隆微生物菌劑的制備及其穩(wěn)定性[J]. 農(nóng)藥，2011，50（6）：420-423.

[20]顧真榮. 蘇云金桿菌晶體毒素穩(wěn)定性和發(fā)酵液保存方法的研究[J]. 微生物學(xué)通報，1984（5）：193-195.

[21]車建美，劉 波，劉國紅，等. 動物益生菌短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA制劑的制備及其益生特性評價[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2017，44（10）：2897-2907.

[22]李劍峰，師尚禮，張淑卿. 不同Ca3（PO4）2含量及菌種保存溫度下SL01菌株的解磷及生長能力[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，18（1）：94-97.